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    丙泊酚減輕低氧誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12炎性反應和細胞凋亡

    2023-01-18 12:18:08祝劍平吳品雯
    基礎醫(yī)學與臨床 2023年1期
    關鍵詞:性反應低氧丙泊酚

    顧 煒,祝劍平,吳品雯

    復旦大學附屬閔行醫(yī)院 麻醉科,上海 201199

    缺氧會引起腦神經(jīng)細胞損傷,導致能量剝奪和功能障礙,伴隨神經(jīng)元凋亡[1]。丙泊酚(propofol)是一種高脂溶性麻醉藥,廣泛用于接受手術或重癥監(jiān)護的患者的麻醉和鎮(zhèn)靜。既往研究表明,丙泊酚具有抗氧化、抗炎等特性,可以改善缺血低氧/再灌注誘導的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12的損傷[2],此外,丙泊酚通過上調微小RNA(microRNA,miRNA/miR)-153,減輕低氧誘導的PC12細胞的神經(jīng)凋亡[3]。然而丙泊酚對低氧誘導PC12細胞氧化應激、炎性反應的影響即調控機制仍未完全闡明。MiRNA指長度為19~24個核苷酸的內源性非編碼RNA。在所有這些已鑒定的miRNA中,miR-141-3p被證明在缺血性卒中隔離后顯著增加,抗miR-141-3p可能用于卒中治療[4]。miR-141-3p在帕金森病體外細胞模型中誘導PC12細胞凋亡、氧化應激和線粒體功能障礙[5]。此外,miR-141-3p的下調是淫羊藿次苷Ⅱ改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的重要途徑之一[6]。但miR-141-3p是否參與丙泊酚影響低氧處理的PC12細胞的過程仍未可知。本研究旨在考察丙泊酚對低氧誘導的PC12細胞凋亡、氧化應激和炎性反應的影響,并通過miR-141-3p探討丙泊酚的潛在機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12(pheochromocytoma cell line, PC12)胞(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫);丙泊酚(Sigma-Aldrich公司);Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen公司);抗miR-141-3p(anti-miR-141-3p)、對照anti-miR-con、miR-141-3p模擬物和模擬物對照miR-con(Ribobio公司);細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒和BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime公司);抗活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved caspase-3)抗體(Abcam公司);PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa公司);SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞的分組和處理:PC12細胞維持在10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中增殖。PC12細胞置于94% N2、5% CO2和1% O2的培養(yǎng)箱中保持48 h。

    將PC12細胞分為對照組、低氧組(刺激PC12細胞48 h)、(5、10、20 μmol/L)丙泊酚(刺激PC12細胞48 h)+低氧組、anti-miR-con+低氧組、anti-miR-141-3p+低氧組、miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組、miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組。其中常氧培養(yǎng)的PC12細胞為對照組,低氧培養(yǎng)的PC12細胞為低氧組,5、10、20 μmol/L丙泊酚給藥后于低氧條件下孵育,為5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組。利用Lipofectamine 3000試劑在PC12細胞中轉染anti-miR-con、anti-miR-141-3p并進行低氧培養(yǎng),為anti-miR-con+低氧組、anti-miR-141-3p+低氧組。PC12細胞中轉染miR-con、miR-141-3p模擬物,并進行20 μmol/L丙泊酚和低氧培養(yǎng),為(miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧)組、(miR-141-3p+20 μmol/L丙泊酚+低氧)組。

    1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡:收獲PC12細胞(5×105個),用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次,然后用結合緩沖液懸浮。按照細胞凋亡試劑盒操作指示,用膜聯(lián)蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)-FITC和碘化丙啶(propid-ium iodide,PI)溶液處理細胞。使用Becton Dickinson FACScan流式細胞儀進行凋亡數(shù)據(jù)分析。

    1.2.3 Western blot檢測cleaved caspase-3蛋白的表達:使用RIPA裂解緩沖液從PC12細胞中提取蛋白質,蛋白濃度用BCA蛋白質測定試劑盒測定。蛋白質通過12% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后,將膜與一抗cleaved caspase-3、內參β-肌動蛋白(β-actin)(4 ℃,過夜)和由辣根過氧化物酶標記的二抗(室溫,1 h)按序孵育。通過增強化學發(fā)光方法捕獲信號,并使用Image Lab軟件進行cleaved caspase-3定量條帶強度分析。

    1.2.4 試劑盒檢測MDA含量、SOD活性:收獲PC12細胞上清液,分別使用檢測試劑盒測定MDA含量和SOD活性。

    1.2.5 活性氧熒光探針DCFH-DA法測定ROS含量:將PC12細胞(1×105個細胞/mL)接種在6孔板中。進行不同處理后,用磷酸鹽緩沖液洗滌PC12細胞,然后在含有10 μmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基中,37 ℃避光培養(yǎng)30 min。用Becton Dickinson FACScan流式細胞儀進行分析,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。

    1.2.6 ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量:收獲PC12細胞上清液,根據(jù)試劑盒操作步驟,使用ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

    1.2.7 RT-qPCR檢測miR-141-3p表達:使用TRIzol從PC12細胞中提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix進行miR-141-3p的cDNA合成。使用SYBR Green Master Mix在ABI 7500儀器上進行基因擴增。miR-141-3p的計算按照2-△△Ct法進行。引物序列如下:miR-141-3p F 5′-CGGGCTAACACTGTCTG GTAAAG-3′,miR-141-3p R 5′-GTGCAGGGTCCGAGG TATTC-3′,內參U6F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6R 5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結果

    2.1 不同濃度丙泊酚對低氧處理的PC12細胞凋亡的影響

    與對照組比較,低氧組PC12細胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表達水平均升高;與低氧組比較,5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表達水平均隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(P<0.05)(表1,圖1)。

    2.2 丙泊酚對低氧處理的PC12細胞氧化應激和炎性反應的影響

    與對照組比較,低氧組PC12細胞的MDA含量增加,SOD活性減弱,ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高;與低氧組比較,5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細胞的MDA含量隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢,SOD活性隨丙泊酚濃度的增加呈升高趨勢,ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(P<0.05)(表2)。

    表1 不同濃度丙泊酚對低氧處理的PC12細胞凋亡的影響

    2.3 丙泊酚對miR-141-3p表達的影響

    與對照組比較,低氧組PC12細胞的miR-141-3p表達量升高;與低氧組比較,5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細胞的miR-141-3p表達量隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(P<0.05)(表3)。

    2.4 Anti-miR-141-3p對低氧處理的PC12細胞凋亡,氧化應激和炎性反應的影響

    Anti-miR-141-3p+低氧組PC12細胞的miR-141-3p表達量、cleaved caspase-3蛋白表達水平、MDA含量均比anti-miR-con+低氧組降低,SOD活性比anti-miR-con+低氧組增加,ROS、 TNF-α、 IL-1β、 IL-6含量和細胞凋亡率均比anti-miR-con+低氧組減少(P<0.05)(表4,圖2)。

    A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot detection of cleaved caspase-3 protein expression圖1 不同濃度丙泊酚對低氧處理的PC12細胞凋亡的影響Fig 1 Effect of different concentrations of propofol on the apoptosis of PC12 cells treated with hypoxia

    表2 丙泊酚對低氧處理的PC12細胞中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

    表3 丙泊酚對miR-141-3p表達的影響

    2.5 miR-141-3p逆轉丙泊酚對低氧處理的PC12凋亡,氧化應激和炎性反應的影響

    miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組PC12細胞的miR-141-3p表達量、cleaved caspase-3蛋白表達水平、MDA含量均高于miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組,SOD活性低于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧組,ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和細胞凋亡率均高于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧組(P<0.05)(表5,圖3)。

    A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein圖2 Anti-miR-141-3p對低氧處理的PC12細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of anti-miR-141-3p on the apoptosis of hypoxia-treated PC12 cells

    表4 Anti-miR-141-3p對低氧處理的PC12細胞凋亡、氧化應激和炎性反應的影響

    表5 miR-141-3p可以逆轉丙泊酚對低氧處理的PC12細胞凋亡、氧化應激和炎性反應的影響

    A.flow cytometry to detect apoptosis; B.Western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein圖3 miR-141-3p可以逆轉丙泊酚對低氧處理的PC12細胞凋亡的影響Fig 3 miR-141-3p could reverse the effects of propofol on hypoxia-treated PC12 cells apoptosis

    3 討論

    細胞凋亡與低氧引起的損傷密切相關,本研究發(fā)現(xiàn)低氧可促進PC12細胞凋亡,但5、10、20 μmol/L丙泊酚降低低氧誘導的細胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白表達,提示丙泊酚保護PC12細胞免受低氧誘導的損傷。在腎缺血/再灌注損傷的小鼠模型中,丙泊酚可以減少細胞凋亡和cleaved caspase-3表達[7]。丙泊酚通過MALAT1/miR-182-5p/TLR4軸減少低氧/復氧的PC12細胞的凋亡[8]。

    已經(jīng)證明氧化應激在低氧誘導的損傷中起著至關重要的作用[9]。有報道,低氧可增加PC12細胞的ROS、MDA,但SOD和過氧化氫酶(catalase,CAT)水平降低[10]。本研究結果與之前報告的結果一致,即低氧會導致PC12細胞發(fā)生氧化應激。丙泊酚治療減輕缺血/再灌注導致的腸、肺形態(tài)學改變,并降低MDA水平和caspase-3表達,使SOD活性升高[11]。本研究中,5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制細胞中ROS產生,降低MDA水平,并恢復抗氧化酶SOD活性,表明丙泊酚可改善低氧引起的PC12細胞氧化應激。

    炎性反應是低氧誘導損傷的另一重要促成因素,在腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中,丙泊酚減輕大鼠神經(jīng)元病理損傷,并降低IL-6及TNF-α水平[12]。本研究中,5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制低氧誘導后PC12細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,表明丙泊酚可以改善低氧引起的PC12細胞炎性反應。

    本研究中,低氧誘導PC12細胞中miR-141-3p表達的增加,而5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制miR-141-3p表達,因此推測丙泊酚調節(jié)低氧后的PC細胞功能可能與抑制miR-141-3p表達有關。在神經(jīng)退行性疾病中,PC12細胞經(jīng)1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium,MPP+)后,miR-141-3p上調[13]。miR-141-3p以時間依賴性方式在中風小鼠中上調,抑制miR-141-3p可改善死亡率、神經(jīng)功能缺損并減少梗塞體積[14]。以上說明miR-141-3p參與神經(jīng)損傷性疾病,但miR-141-3p在低氧誘導PC12細胞損傷中的作用尚不清楚。本研究結果顯示,抑制miR-141-3p可以導致MDA、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和細胞凋亡率增加,SOD活性降低,表明miR-141-3p能加劇低氧誘導的PC12細胞損傷。進一步的結果發(fā)現(xiàn),miR-141-3p可以逆轉丙泊酚對低氧處理的PC12凋亡,氧化應激和炎性反應的影響。提示丙泊酚可以通過下調miR-141-3p的表達抑制低氧誘導的PC12細胞損傷。

    總之,丙泊酚可以通過抑制miR-141-3p的表達,減輕低氧誘導的PC12細胞凋亡、氧化應激和炎性損傷。

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