菊苣總黃酮緩解酒精所致小鼠急性肝損傷

龐佳慧，徐福飛， 3，江海濤，李盛杰，霍光明，吳雨龍*

(1. 南京曉莊學院 食品科學學院，江蘇 南京 211171；2. 江蘇省高?！疤厥馍镔|廢棄物資源化利用”重點建設實驗室，江蘇 南京 211171；3. 南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京 210046)

各式各樣的酒因其獨特的口味而在世界各地廣受歡迎.隨著酒消費量的大大增加，肝臟疾病也隨之增加.近年來，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)病率一直在逐年上升.長期或過量飲酒已經成為導致肝病的最主要因素之一[1].ALD主要包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化等，如不加以控制將最終發(fā)展成為肝癌[2].目前，臨床上仍然沒有有效治療ALD的藥物.ALD可能的發(fā)病機制主要包括與酒精代謝有關的氧化應激損傷、蛋氨酸代謝異常、炎癥介質損傷、營養(yǎng)失衡等[3].現已證明體內酒精代謝過程中的氧化應激可誘導肝臟線粒體功能障礙、脂肪變性、炎癥和纖維化[4-7].因此，調節(jié)肝臟炎癥，調控ALD肝臟氧化應激反應機制，減少肝臟炎癥和免疫損傷反應，可為ALD的防治提供新的靶點.

菊苣，菊科菊苣屬，系維吾爾族習用藥材，具有清肝利膽，健胃消食，利尿消腫等功效.菊苣富含黃酮類、多酚類、多糖、菊苣酸等多種功能活性成分[8].Mohafrash等[9]發(fā)現菊苣和洋薊葉的草藥糖漿可通過增加體重及抗氧化酶、減少脂質過氧化作用來改善溴氰菊酯對斷奶雄性大鼠的肝損傷.Wu等[10]研究表明菊苣多糖通過激活AMPK信號通路來減輕高脂肪飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病.Keshk等[11]證明在膳食中添加菊苣可以緩解氧化應激并通過AMPK/SIRT1/FXR信號通路中斷炎癥通路來有效預防硫代乙酰胺誘導的肝損傷、纖維化和肝硬化.然而，有關菊苣總黃酮(Chicory total flavonoids, CTF)的肝保護特性尚未在動物體內進行實驗探索，因此，本研究探究了CTF對急性酒精性肝病小鼠模型的作用，為研制開發(fā)菊苣保肝食品或天然藥物提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊苣總黃酮(CTF)由南京曉莊學院食品科學學院生物功能分子研究室提供.

雄性ICR小白鼠，動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0001，體質量18～22 g，南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供；總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)試劑盒(北京北華康泰臨床試劑有限公司)；谷草轉氨酶(AST)測試盒、谷丙轉氨酶(ALT)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、蛋白定量測試盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol Reagent(賽默飛世爾科技有限公司)；PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒和SYBR Premix Ex Taq TM II(日本TaKaRa公司)；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設備

BioTek 多功能酶標儀、ELx50 洗板機(美國BioTek 儀器有限公司)；H600L 尼康顯微鏡(日本尼康公司)；ND-1000 微量紫外可見分光光度計(美國Nanodrop公司)；Mx3000P 熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)；Mikro-22R 高速冷凍離心機(德國Andreas Hettich GmbH8 CO.KG).

1.3 實驗方法

1.3.1 CTF的制備

取100.0 g菊苣粉末于燒杯中，加入3700 mL的70%乙醇溶液，按照菊苣粉末量加入2.2%的混合酶(纖維素酶和果膠酶)，攪拌均勻，封上保鮮膜，酶解66 min后，將燒杯放入95 ℃水中10 min滅酶，接著用超聲波處理(超聲功率59 W，超聲時間24 min)提取液，抽濾，得澄清濾液，濃縮后經聚酰胺樹脂70%乙醇洗脫純化，洗脫液濃縮，冷凍干燥得CTF[12].

1.3.2 急性酒精肝損傷動物模型的建立

小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白對照組、酒精模型組、陽性對照組(西利馬林)、CTF低劑量組和高劑量組，每組10只.空白對照組和酒精模型組灌胃純凈水，陽性對照組灌胃西利馬林(10 mg/kg bw)，CTF低高劑量組分別灌胃50、100 mg/kg bw菊苣總黃酮，連續(xù)15 d.期間每天觀察小鼠生活狀態(tài)，每3 d稱重小鼠一次，并根據小鼠體重調整灌胃劑量.第15 d，除空白對照組外，其余各組在分別灌胃給藥6 h后，均灌胃56度紅星二鍋頭白酒(12 mL/kg bw)，建立小鼠急性酒精肝損傷模型.

1.3.3 指標檢測

各組小鼠在末次灌胃白酒禁食18 h后，用乙醚麻醉，眼球摘除法采血，3000 r/min離心10 min，分離血漿，經試劑盒測定血漿指標(TC、TG、ALT和AST).小鼠解剖后迅速切除肝臟并稱重，部分肝臟用福爾馬林固定以進行組織學研究；部分肝臟經試劑盒用于生化分析(MDA、GSH、GSH-PX和SOD)；其余肝臟在液氮中快速冷凍，在-70 ℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR分析.

1.3.4 肝臟中基因表達的實時熒光定量PCR分析

取60 mg肝臟組織，用Trizol 試劑根據銷售商提供的操作指南提取總RNA.用ND-1000 微量紫外可見分光光度計檢測總RNA 的純度和濃度，置于-70 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?用PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒按操作說明合成cDNA第一鏈.以SYBR Premix Ex Taq TM II和2 μL稀釋的cDNA為模板，參照操作指南進行反應.用Primers 6.0軟件設計目的基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1.

表1 目的基因引物序列

PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，一共進行40個循環(huán).每組實驗重復三次.以β-Actin為內參基因，采用2-ΔΔCT法[13]來計算目的基因轉錄的相對表達量，ΔΔCT=CT目的基因-CT內參基因.

1.3.5 肝臟病理切片制作

取小鼠右葉相同位置肝臟，用4 ℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學變化.

1.3.6 統(tǒng)計學分析

所有實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行分析，統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析法及t檢驗法分析各組之間的差異，P<0.05為顯著性標準，采用Graphpad prism 6作圖分析結果.

2 結果與分析

2.1 CTF對小鼠生長情況及體重的影響

實驗期間，各組小鼠精神狀態(tài)較好，活潑好動，被毛平順有光澤，體重不斷增長，各組小鼠體重不存在明顯差異，結果如圖1所示.在灌胃56度紅星二鍋頭白酒后，除空白對照組外，其余各組小鼠出現行走不穩(wěn)，四肢癱軟，呼吸急促，重者嗜睡醉倒等情況，此狀態(tài)一直持續(xù)1 h左右.18 h后，酒精模型組小鼠仍然精神萎靡不振，反應遲鈍，嗜睡，而陽性對照組和CTF劑量組小鼠恢復較快，活動量增多，食欲和整體精神狀態(tài)恢復較好.結果表明，預先灌胃CTF不影響小鼠體重變化，且可緩解酒精帶來的對小鼠的影響.

圖1 CTF對小鼠體重的影響

2.2 指標檢測結果

2.2.1 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響

小鼠的肝臟指數可部分反映肝損傷的程度.由圖2可知，空白對照組、陽性對照組及CTF高劑量組與酒精模型組相比肝臟指數有顯著性差異(P<0.05).結果表明，CTF能夠緩解酒精對肝臟的損傷，具有一定的保肝作用.

圖2 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響＊與模型組相比，差異顯著(P<0.05)；下同.

2.2.2 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT 、AST、TC和TG的影響

ALT 和AST是評價動物肝功能和健康狀況的常用指標，可以反映動物的肝損害和健康狀況.由圖3A和B可知，空白對照組與酒精模型組相比，血漿ALT和AST活性差異顯著(P<0.05)，表明ALD小鼠模型建模成功.而灌胃CTF和西利馬林組小鼠血漿中ALT和AST活性有不同程度的降低，且CTF高劑量組和陽性對照組與酒精模型組相比差異顯著(P<0.05).圖3C和D顯示了空白對照組與酒精模型組相比，血漿TC和TG的含量差異顯著(P<0.05)，而陽性對照組和CTF組含量有不同程度下降，且對于TC含量，CTF高劑量組和陽性對照組與酒精模型組相比差異顯著(P<0.05)；TG含量，CTF各劑量組和陽性對照組與酒精模型組相比差異均顯著(P<0.05).提示CTF具有較好的保護肝臟受損、降低血漿轉氨酶和脂質在肝臟中沉積的能力.

圖3 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT 、AST、TC和TG的影響

2.2.3 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、GSH、GSH-PX和SOD的影響

肝損傷總是與異常的氧化應激相關[14].因此，通過檢測MDA、GSH、GSH-PX和SOD四種肝臟氧化應激指標，可以檢驗CTF是否能改善酒精所致?lián)p傷引起的肝臟氧化應激.由圖4可知，過量飲酒會導致肝臟中MDA含量顯著上升，而GSH-PX和SOD活性以及GSH含量明顯下降，表明ALD小鼠肝臟氧化應激水平明顯升高.與酒精模型組相比，經西利馬林和CTF作用后，各組小鼠抗氧化能力有不同程度的提高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，GSH-PX和SOD活性顯著上升(P<0.05).此外，CTF高劑量組GSH含量顯著上升(P<0.05).提示CTF具有較好的改善肝組織氧化應激的能力.

圖4 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、GSH、GSH-PX和SOD的影響

2.3 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟中HO-1、Nrf-2、CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因mRNA表達的影響

為了探討CTF抗酒精性肝病活性的分子機制，分析了肝臟中與氧化應激相關的基因(HO-1、Nrf-2和CYP2e1)、脂質過氧化基因(FAS)和免疫調節(jié)基因(TNF-α和TLR-4)的表達水平，結果見圖5.與模型組相比，陽性對照組和CTF組HO-1和Nrf-2基因的表達明顯升高(P<0.05)，而CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因的表達則顯著降低(P<0.05).提示CTF具有緩減由酒精引起的肝組織氧化應激、降低脂質在肝臟中的積累以及提高機體免疫力的功效.

圖5 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟中HO-1、Nrf-2、CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因mRNA表達的影響

2.4 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響

病理觀察可以直接驗證CTF是否對酒精所致的急性肝損傷具有緩減作用.各實驗組結果如圖6所示，空白對照組肝細胞排列整齊，細胞核圓而清晰，胞漿豐富，無明顯組織學病變(圖6A).不同的是，在酒精模型組中，暴露于酒精中的小鼠出現肝小葉破壞、肝索紊亂、肝細胞腫脹、肝細胞球囊化和核固縮(圖6B).然而，經CTF處理的實驗組，肝損傷明顯降低，且呈現劑量依賴狀態(tài)(圖6D-E)，特別是CTF高劑量組(圖6E)，肝細胞改善情況與陽性對照組相似(圖6C).提示CTF對酒精所致急性肝損傷有較好的緩減作用.

A.空白對照組；B. 酒精模型組；C.陽性對照組；D. CTF低劑量組；E. CTF高劑量組圖6 CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響(HE， ×400)

3 討論

近些年來，對天然活性產物防治酒精性肝病的研究進一步深入.大多數報道主要集中在天然多糖對酒精性肝病的防治，如鐵皮石斛多糖、平菇菌絲體多糖、云芝菌絲體多糖等[15-17].此外，也有關于二酮類和三萜類藥物對肝臟的保護作用的報道[18，19].本研究探討了CTF對酒精所致急性肝損傷小鼠的影響.同時發(fā)現CTF組的小鼠生長情況和體重與空白對照組比較無明顯差異，即灌胃CTF對小鼠的生長和體重無影響.

動物肝臟指數可部分反映肝損傷的程度.本研究中，與空白對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟指數顯著上升；而與酒精模型組相比，CTF各劑量組的肝臟指數出現不同程度降低，且CTF高劑量組與酒精模型組差異顯著，接近空白對照組和陽性對照組水平，表明CTF能夠抑制肝細胞腫脹，緩解酒精對肝臟的損傷.

血清生化指標ALT和AST是衡量肝功能是否正常的重要指標，當肝臟受到酒精的影響，肝組織受損，肝細胞膜通透性增加，血液中ALT和AST水平會明顯升高[20].本研究顯示，與空白對照組相比，酒精模型組血漿 ALT和 AST的水平均顯著的升高，而CTF各劑量組不同程度降低了酒精所致急性肝損傷小鼠血清中ALT 和 AST 水平，表明CTF可以緩解酒精對肝臟的損害.人體內的TC和TG主要在肝臟中合成，若肝臟受損，則血液中游離脂肪酸水平上升，導致血液中TG水平升高，引起高TG血癥，致使肝臟合成TC能力增強，引起血液中TC濃度升高.因此血清中TC和TG含量的高低間接反映了肝臟受損的程度[21].本研究顯示，與酒精模型組相比，CTF各劑量組可以緩減酒精所致的小鼠急性肝損傷，降低血清中TC和TG含量.

飲酒引起的氧化應激是各種肝病常見的病理生理學特征[22].過度的飲酒可以降低機體中SOD、GSH、GSH-PX等抗氧化酶的水平，增加脂質過氧化的產物MDA，誘導肝組織損傷.本研究發(fā)現，酒精模型組小鼠肝臟SOD、GSH和GSH-PX活性明顯低于空白對照組和陽性對照組，而MDA含量明顯升高；CTF各劑量組可以不同程度提高肝受損小鼠肝臟中SOD、GSH和GSH-PX活性，降低MDA的含量，表明預先灌胃CTF能夠提高機體應對氧化應激的能力.

在肝細胞中，細胞色素氧化酶P4502E1(CYP2e1)是參與酒精代謝的主要酶之一，具有較強的NADPH氧化酶活性，它可以使酒精氧化產生活性氧基團，誘導氧化應激反應，導致細胞死亡或凋亡[23]，而Nrf-2可以調節(jié)氧化應激并減少炎癥反應，當其處于氧化應激環(huán)境中時，CYP2e1被解離.HO-1是Nrf-2已知的靶基因，當Nrf-2被激活時，HO-1表達增加，從而保護機體免受損傷[24].研究表明，酒精攝入可上調FAS基因的轉錄，該基因與脂肪酸合成密切相關，并影響脂質代謝[25].炎癥也是引起酒精性肝病的一個重要因素.有報道稱，肝實質細胞中TLR-4的激活可以促進TNF-α的釋放，增加促炎細胞因子和炎癥反應[26].本研究結果表明，CTF可以減輕酒精對肝臟氧化應激、脂質代謝和炎癥相關基因表達的負面影響.

病理學切片觀察能夠直觀反映肝臟病理變化情況.本研究中，酒精模型組小鼠肝細胞出現腫脹、水樣變性、點狀壞死等病理改變.而預先灌胃CTF的小鼠肝組織的病理損傷和炎癥反應能明顯減輕，且病理改善作用呈劑量相關性，CTF劑量越大，改善越明顯.

綜上所述，菊苣總黃酮能夠明顯緩解酒精所致小鼠急性肝損傷，在預防急性酒精性肝損傷方面很有開發(fā)前景.