近紅外光譜技術(shù)在閩楠葉片氮含量測(cè)定中的應(yīng)用

涂白連,伍艷芳,,劉新亮,鄭永杰,張?jiān)骆?徐海寧

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,南昌 330045；2.江西省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家林業(yè)草原樟樹工程技術(shù)研究中心,南昌330032)

閩楠(Phoebebournei(Hemsl.)Yang),樟科楠屬常綠大喬木,中國(guó)特有,被列為國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危種,同時(shí)也是江西省重要鄉(xiāng)土珍貴闊葉用材樹種[1-3]。江西省的閩楠資源豐富,楠木種植面積2萬(wàn)hm2(30萬(wàn)畝)以上,但在楠木人工林的營(yíng)建過(guò)程中,有50%以上的人工林需根據(jù)營(yíng)養(yǎng)診斷結(jié)果進(jìn)行肥力提升或低產(chǎn)低效林改造,因此,亟需提升閩楠的營(yíng)養(yǎng)診斷技術(shù),改善林地肥力結(jié)構(gòu),實(shí)施森林質(zhì)量精準(zhǔn)提升。氮素(N)是閩楠生長(zhǎng)過(guò)程中所必需的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一,同時(shí)也是限制閩楠生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的重要因素,恰當(dāng)?shù)氖┯玫什坏軌蛴行Т龠M(jìn)閩楠生長(zhǎng),還能提升其產(chǎn)量[4-7]。實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、快速的檢測(cè)閩楠氮素營(yíng)養(yǎng)水平,對(duì)楠木營(yíng)養(yǎng)診斷技術(shù)的提升具有重大意義。傳統(tǒng)的植物氮素檢測(cè)方法主要有形態(tài)診斷、組織全氮含量診斷、硝酸鹽快速診斷和土壤化學(xué)診斷等[8],但這些方法均存在一定的弊端,難以實(shí)現(xiàn)大面積的推廣使用；現(xiàn)代的檢測(cè)方法主要有葉綠素儀診斷[9]、葉綠素?zé)晒夥╗10]、遙感技術(shù)診斷[11]、可見近紅外光譜技術(shù)(NIRs)等[12]。近年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,近紅外光譜技術(shù)也得到相當(dāng)程度的發(fā)展和完善,應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)無(wú)損、快速地測(cè)定多種植物生化組分含量已經(jīng)能夠很好實(shí)現(xiàn)[13-14]。吳靜珠等[15]通過(guò)比較競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)采樣法(CARS)、蒙特卡羅無(wú)信息變量消除法(MCUVE)、向后間隔偏最小二乘法(BiPLS)、組合間隔偏最小二乘法(SiPLS)等4種特征譜區(qū)篩選方法,優(yōu)選出BiPLS為最適合建立番茄葉片氮含量模型的方法,并建立了最優(yōu)定量分析模型；張玉森等[16]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法(PLS),經(jīng)光譜預(yù)處理和建模譜區(qū)選擇,建立了水稻鮮葉和粉末氮含量預(yù)測(cè)模型；胡永光等[17]以茶樹活體鮮葉為研究對(duì)象,利用便攜式光譜儀于田間收集了86個(gè)茶鮮葉樣品的漫反射光譜信息,通過(guò)選擇建模波段、預(yù)處理方法、建模方法等步驟,建立了茶鮮葉全氮含量近紅外光譜預(yù)測(cè)模型。

截至目前,尚無(wú)將NIRs技術(shù)與閩楠營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)和應(yīng)用相結(jié)合的研究報(bào)道。因此,本文將近紅外光譜分析技術(shù)與閩楠葉片氮含量預(yù)測(cè)相結(jié)合,以期得到一種快速便捷的閩楠葉片氮含量檢測(cè)方法。以江西省永豐縣官山林場(chǎng)國(guó)家楠木良種基地采集到的高產(chǎn)組和低產(chǎn)組共64份閩楠葉片樣品為材料,其中54份用于模型建立,余下10份用于模型的外部驗(yàn)證。通過(guò)常規(guī)的組織全氮含量診斷法獲得閩楠葉片的全氮含量作為實(shí)測(cè)值,應(yīng)用近紅外光譜儀采集閩楠干葉粉末樣品的近紅外光譜信息,通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合軟件分析,選擇最佳建模方法、建模波段、預(yù)處理方法,最終得到預(yù)測(cè)效果最優(yōu)的模型。用10份未知樣品對(duì)模型進(jìn)行外部檢驗(yàn),結(jié)合配對(duì)樣本T檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型,以期為閩楠營(yíng)養(yǎng)水平實(shí)時(shí)測(cè)評(píng)技術(shù)的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

2021年5月下旬,于江西省永豐縣官山林場(chǎng)楠木種子園,隨機(jī)選擇高產(chǎn)組和低產(chǎn)組各32棵單株,每單株為1個(gè)樣本,采集中部功能葉片,不帶小枝,共得到64份閩楠葉片樣品。

所用近紅外光譜采集儀器為瑞士BUCHI公司生產(chǎn)的傅里葉變換近紅外光譜儀NIRFlex N-500,及其配套的Operator光譜采集軟件和NIRCal分析軟件,儀器光譜范圍為1 000～2 500nm,分辨率為13.38nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

閩楠葉片經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純水洗凈晾干,于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中105℃殺青10～30min,在調(diào)至80℃烘干至恒重,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粉末狀,最終得到閩楠干葉粉末樣品,裝入聚四氟乙烯封口袋中,避光干燥保存待用。其中54份作為建模集參與建模,另隨機(jī)選取10份作為外部驗(yàn)證集用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.2.2近紅外光譜采集

將葉片粉末裝入Petri培養(yǎng)皿中,裝樣厚度15mm,反射蓋壓實(shí),置于近紅外光譜儀器上進(jìn)行光譜測(cè)定。使用Management軟件設(shè)置光譜掃描參數(shù):掃描范圍1 000～2 500nm,掃描次數(shù)32次,分辨率13.38 nm,環(huán)境溫度保持恒定24～25℃。采取單個(gè)樣品重復(fù)裝樣3次、掃描3次,得到3張光譜,取其平均光譜作為該樣品的表征光譜。

1.2.3氮含量測(cè)定

參考鮑士旦[18]的方法進(jìn)行閩楠養(yǎng)分含量測(cè)定,氮、磷、鉀含量分別采用凱氏定氮法、鉬銻抗比色法和火焰光度計(jì)法測(cè)定。

1.2.4模型建立

利用儀器配套的Operator軟件采集樣品近紅外光譜,將所測(cè)得的樣品實(shí)測(cè)值賦值于所采集得到的近紅外光譜,導(dǎo)入配套的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件NIRCal進(jìn)行相關(guān)分析,依次通過(guò)選擇合適的建模方法、最佳建模波段、預(yù)處理方法建立定量分析模型。選用內(nèi)部交叉驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚19],外部驗(yàn)證的方法評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)效果。以校正集相關(guān)系數(shù)Rc(Related coefficient of calibration)、校正集均方根誤差RMSEC(Root Mean Square Error of Calibration)、交互驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)Rv(Related coefficient of validation)、交互驗(yàn)證均方根誤差RMSEV(Root Mean Square Error of Validation)、殘差(BIAS)等5個(gè)值對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià),以確定最優(yōu)模型。

1) 建模方法選擇。近紅外光譜分析中,主要的建模方法有偏最小二乘法(PLS)、主成分回歸(PCR)、多元線性回歸(MLR)等線性校正方法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)、支持向量機(jī)(SVN)等非線性校正方法[20-22]。本研究主要選擇PLS和PCR這2種方法對(duì)模型進(jìn)行構(gòu)建,并比較其效果。

2) 建模波段選擇。在全光譜段上不是所有的光譜信息都是對(duì)總提取物含量的預(yù)測(cè)有用,無(wú)效的光譜信息會(huì)影響所建模型的精度[16]。因此,選擇特定有效的光譜區(qū)域參與建模能夠在一定程度上優(yōu)化模型,提高模型的預(yù)測(cè)效果。

3) 預(yù)處理方法選擇。近紅外光譜的實(shí)測(cè)光譜為樣品的表觀光譜(Apparent spectrum),表觀光譜由能夠表征樣品的真實(shí)光譜(Real spectum)和不確定的背景(Background)組成。樣品的真實(shí)光譜包含了大部分物理、化學(xué)和生物等確定信息,其中有需要用到的確定信息,也有不需要的信息[23]。此外,光譜基線偏移、高頻噪音、斜坡背景等偏差也會(huì)影響建模的準(zhǔn)確性,增加近紅外光譜分析的難度[24-25]。因此,在建立近紅外光譜模型時(shí),需要對(duì)近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理,以消除這些干擾信息對(duì)模型精度造成的影響。

1.2.5模型的評(píng)價(jià)及外部驗(yàn)證

近紅外光譜校正模型效果的評(píng)價(jià),可以從模型自身相關(guān)性和外部預(yù)測(cè)能力2個(gè)方面進(jìn)行[26]。評(píng)價(jià)參數(shù)方面,較高的Rc和Rv,較低的RMSEC和RMSEV是一個(gè)好的預(yù)測(cè)模型應(yīng)該具備的條件,其中Rv和RMSEV又更為重要。這主要是因?yàn)殡m然模型具有較高的Rc和較低的RMSEC,表示其預(yù)測(cè)建模樣品的能力更強(qiáng),但這也可能造成模型過(guò)擬合；而Rv和RMSEV代表模型在預(yù)測(cè)外部樣本時(shí)的準(zhǔn)確性,更高的Rv和更低的RMSEV就表明模型預(yù)測(cè)外部樣本時(shí)更準(zhǔn)確,同時(shí)RMSEC和RMSEV越接近越好[20,24,27-28]。模型的外部驗(yàn)證方面,通過(guò)將10份未參與建模樣品的近紅外光譜圖導(dǎo)入模型進(jìn)行預(yù)測(cè),比對(duì)模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值,對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)。在利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn),驗(yàn)證該方法的可靠性[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 閩楠葉片氮含量的實(shí)測(cè)值

測(cè)定得到的樣品全氮含量結(jié)果如表1所示。所測(cè)64份閩楠葉片樣品的氮含量最大值為19.15g/kg,最小值為9.29g/kg,平均氮含量為13.28g/kg。樣品含量涵蓋范圍較廣,具有一定的代表性,可用于近紅外光譜技術(shù)分析。

表1 閩楠樣品氮含量實(shí)測(cè)值描述性統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Descriptive statistics table of the measured value of nitrogen content in P.bournei. samples

2.2 譜圖分析和建模方法的選擇

由圖1可看出,在整個(gè)光譜波段內(nèi),閩楠干葉粉末的近紅外光譜總體變化趨勢(shì)基本一致,這可能是由于閩楠葉片的物質(zhì)組成基本相同；但不同樣品在同一波長(zhǎng)下反射率方面有一定的差異,并非完全相同,說(shuō)明葉片的內(nèi)部組成存在一定的差異。這表明近紅外光譜分析技術(shù)可用于閩楠全氮含量的定量分析。

圖1 所有樣品的近紅外光譜圖Fig.1 Near-infrared spectra of all samples

本研究選用偏最小二乘法(PLS)和主成分回歸(PCR)2種方法分別建立定量模型,從中選擇出最恰當(dāng)?shù)慕７椒?結(jié)果如表2所示。2種方法所建模型的Rc值均高于0.9,但PCR方法所建模型的Rv值更高,RMSEV也更低,且RMSEC和RMSEV值更為接近,所以可得出PCR方法建立的模型效果更好。

表2 不同建模方法氮含量預(yù)測(cè)模型表現(xiàn)比較Tab.2 Comparison of model performance of nitrogen content prediction by different modeling approaches

2.3 特征波段的選擇

應(yīng)用PCR方法,選擇不同的光譜區(qū)域建模,結(jié)果如表3所示。雖然在3個(gè)波段內(nèi)建立的模型Rc值均高于0.9,但觀察表中數(shù)據(jù)會(huì)發(fā)現(xiàn)在1 000～1 350nm,1 400～2 000 nm范圍內(nèi)建立的模型具有更高的Rv值和更低的RMSEV值,且其RMSEC值和RMSEV值最為接近。由此表明,選擇1 000～1 350nm,1 400～2 000 nm波段建立的模型效果更好。

表3 不同光譜波段范圍氮含量預(yù)測(cè)模型表現(xiàn)比較Tab.3 Comparison of the performance of nitrogen content prediction models in different spectral band ranges

2.4 預(yù)處理方法的選擇

選擇1 000～1 350,1 400～2 000nm建模波段,使用標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)、導(dǎo)數(shù)(Derivatives)、平滑(Smoothing)等方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,其結(jié)果如表4所示。經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)(db1)、二階導(dǎo)數(shù)(db2)、SG(savitzky-golay filter)平滑、結(jié)合單位長(zhǎng)度歸一化(nle)、乘法散射校正MSC和SNV標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理方法所建立的模型,各參數(shù)較為接近,但仔細(xì)比較后發(fā)現(xiàn),經(jīng)“一階導(dǎo)數(shù)(db1)、平滑SG(savitzky-golay filter)和結(jié)合單位長(zhǎng)度歸一化(nle)”預(yù)處理方法所建立的模型具有更高的Rv值和更低的RMSEV,效果最佳。圖2為經(jīng)預(yù)處理后所有樣本的光譜圖。

表4 不同光譜預(yù)處理方法氮含量預(yù)測(cè)模型表現(xiàn)比較Tab.4 Comparison of the performance of nitrogen content prediction models with different spectral pretreatment methods

2.5 模型的建立

選擇1 000～1 350nm,1 400～2 000nm組合波段,經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)、平滑SG和結(jié)合單位長(zhǎng)度歸一化預(yù)處理,利用PCR方法建立閩楠葉片氮元素含量模型,模型的各參數(shù)如表5所示。圖3是模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的關(guān)系圖,由圖可知,模型的預(yù)測(cè)值和樣品實(shí)測(cè)值間沒(méi)有顯著差異,且偏差較小。

圖2 光譜預(yù)處理效果圖Fig.2 Effect diagram of spectral pre-treatment

表5 近紅外模型建立結(jié)果參數(shù)Tab.5 Parameters of near-infrared model establishment result

圖3 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值關(guān)系圖Fig.3 Relationship between predicted values and measured values

2.6 模型的驗(yàn)證

將10個(gè)未知樣品的近紅外光譜圖導(dǎo)入模型檢驗(yàn)所建模型的預(yù)測(cè)能力,結(jié)果如表6所示。預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的相對(duì)偏差在0.070%～0.705%范圍內(nèi),預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值接近,表明模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值具有較高的相關(guān)性。

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法,結(jié)合SPSS分析軟件,對(duì)閩楠樣品氮含量的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn),結(jié)果如表7所示。P值為0.116,大于0.05,沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明NIR結(jié)合PCR對(duì)閩楠葉片粉末樣品的氮元素含量進(jìn)行快速分析是可行的。

表6 閩楠葉片氮含量外部驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 The results of external verification of nitrogen content in leaves of P.bournei

表7 外部驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值T檢驗(yàn)結(jié)果Tab.7 T-test results of predicted and measured values of external verification

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果表明,借助近紅外光譜儀,采集閩楠干葉粉末的光譜數(shù)據(jù),結(jié)合其傳統(tǒng)分析方法測(cè)得的理化值,經(jīng)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法處理可建立閩楠葉片氮含量預(yù)測(cè)模型。所建模型經(jīng)外部檢驗(yàn),結(jié)果也無(wú)顯著差異,這說(shuō)明應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)建立閩楠葉片氮含量預(yù)測(cè)模型可行,該方法具備一定的創(chuàng)新性,可為閩楠營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)技術(shù)的改善提供參考。

相比于傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法,近紅外光譜技術(shù)有著分析快速、無(wú)損,可實(shí)施大批量樣品快速檢測(cè)和實(shí)時(shí)在線分析的特點(diǎn)[29],已逐漸替代傳統(tǒng)分析方法,在工農(nóng)業(yè)分析領(lǐng)域得到了廣泛的運(yùn)用[30]。在植物氮含量檢測(cè)方面,近紅外光譜分析技術(shù)相關(guān)的研究現(xiàn)階段主要集中在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物:小麥[31-32]、蘋果[27,33-35]、茶[17,36]等方面,對(duì)于林業(yè)經(jīng)濟(jì)樹種方面的研究較少[37]。本研究針對(duì)閩楠葉片建立近紅外光譜氮含量檢測(cè)模型,與前人的研究相比:建模方法方面,凌智剛等[38]利用偏最小二乘回歸方法建立的煙葉的總氮含量檢測(cè)模型,得到了較高精確度的模型,本研究采用的建模方法為主成分回歸,對(duì)比使用偏最小二乘法所建立的預(yù)測(cè)效果更好。樣品光譜采集方式方面,本研究參與建模的樣品為閩楠干葉粉末,這在一定程度上規(guī)避了閩楠葉片水分對(duì)葉片光譜造成的影響,但制作葉片粉末樣品的過(guò)程較繁瑣。以往有大量的學(xué)者直接應(yīng)用植物鮮葉構(gòu)建相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)模型[16-17,33,39],因此下一步可對(duì)閩楠鮮葉光譜進(jìn)行研究,利用閩楠鮮葉直接構(gòu)建閩楠葉片氮含量近紅外光譜預(yù)測(cè)模型。植物葉片有機(jī)成分含量檢測(cè)方面,集中在氮含量檢測(cè)方面的研究較多,但也有學(xué)者運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)對(duì)葉片其他有機(jī)成分的檢測(cè)進(jìn)行了研究,石吉勇等[40]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)算法建立了黃瓜葉片磷元素虧缺快速診斷模型,模型識(shí)別率達(dá)到100%。前人的研究結(jié)果表明,應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)植物葉片的磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分是可行的,因此,后期可嘗試對(duì)閩楠其他營(yíng)養(yǎng)成分(如P,K等)的近紅外預(yù)測(cè)模型進(jìn)行相關(guān)研究,可為閩楠營(yíng)養(yǎng)成分的快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)提供新的技術(shù)途徑。