基于高密度培養(yǎng)的阿維菌素發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉進(jìn)峰，程 曦，劉麗虹，高亞琪，王學(xué)偉，王習(xí)琢

(1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 051530；2.石家莊市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，石家莊050000)

高密度指菌體生物量大于60 g/L，其培養(yǎng)方式多應(yīng)用于菌體的生產(chǎn)和初級(jí)代謝產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)[1]。而阿維菌素作為阿維鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，菌體密度較低，通過菌種改良、配方優(yōu)化和控制工藝調(diào)整，阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平已得到大幅提高，特別是隨著合成生物學(xué)的興起，中科院微生物研究所與河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司等利用基因編輯技術(shù)，采用“5M”策略[2]，對(duì)阿維鏈霉菌菌種進(jìn)行的定向改造，構(gòu)建的主產(chǎn)B1a菌株應(yīng)用于阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)，平均發(fā)酵效價(jià)達(dá)7 000μg/mL，該成果也因此獲得2016年國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)[3]。比較大生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室2種發(fā)酵狀態(tài)生化參數(shù)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室生物量及其發(fā)酵效價(jià)可分別高達(dá)52~55 g/L和8 000~9 000 μg/mL，但工業(yè)化生產(chǎn)生物量?jī)H46~48 g/L，發(fā)酵效價(jià)僅7 000μg/mL。大生產(chǎn)發(fā)酵效價(jià)難以達(dá)到其實(shí)驗(yàn)室水平，且為實(shí)現(xiàn)最大效益，工業(yè)化生產(chǎn)還需考慮發(fā)酵過程中的能源節(jié)約。盡管生物量大只是效價(jià)高的必要但不充分條件，但工業(yè)化生產(chǎn)過程中，仍有必要通過發(fā)酵配方的調(diào)整增加阿維鏈霉菌的生物量。不過，生物量的增加意味著與之對(duì)應(yīng)的攪拌轉(zhuǎn)速、風(fēng)量等控制參數(shù)的調(diào)整，否則，可能出現(xiàn)因溶氧不足或質(zhì)能傳遞障礙，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵代謝異常而達(dá)不到提高效價(jià)的目標(biāo)。

本文基于比較2種狀態(tài)下的生物量、發(fā)酵效價(jià)，通過發(fā)酵配方的調(diào)整，增加工業(yè)化生產(chǎn)的生物量，調(diào)整優(yōu)化與之對(duì)應(yīng)的發(fā)酵控制參數(shù)，以達(dá)到提高發(fā)酵效價(jià)，增加企業(yè)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-09，河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.2 儀器

SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；TS-211B臥式恒溫?fù)u床(無錫瑪瑞特科技有限公司)；P-230高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫干燥箱(上海環(huán)竟試驗(yàn)設(shè)備廠)。

1.1.3 發(fā)酵罐

120 m3碳鋼發(fā)酵罐由江蘇揚(yáng)州永鋒工業(yè)設(shè)備安裝有限公司制作，裝配有3層攪拌器，最下層攪拌器HY(CD-6)為徑向流式半圓管結(jié)構(gòu)，中上層攪拌器KSX(A-315)為軸向流式。最下層攪拌器直徑1.23 m，中間和上層攪拌器直徑1.35 m，攪拌器間距2.55 m，罐高9.22 m，罐直徑3.82 m。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為淀粉170~178 g/L，熱軋黃豆餅粉28~32 g/L，酵母粉6~10 g/L，玉米漿2~6 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣1.2~1.6 g/L，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%。搖瓶裝量：250 mL三角瓶裝量40 mL，接種量：2~4 mL。

搖瓶培養(yǎng)條件：溫度27~28℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)時(shí)間10~12 d。

1.2.2 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

質(zhì)量濃度分別為淀粉172 g/L，熱軋黃豆餅粉25 g/L，酵母粉10 g/L，玉米漿3 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%。消后體積32~35 L，接種量：8%~10%。

搖瓶培養(yǎng)條件：溫度27~28℃，攪拌轉(zhuǎn)速400~600 r/min，風(fēng)量1.0~1.2 L/(L·min)，培養(yǎng)時(shí)間14~16 d。

1.2.3 種子罐(12 m3)培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為淀粉20 g/L，熱軋黃豆餅粉5 g/L，酵母粉5 g/L，花生粉5 g/L，氯化鈷10 mg/L；消后體積8~9 m3、pH 7.5~8.0。

培養(yǎng)條件：溫度28~29℃，空氣流速400~600 m3/h，培養(yǎng)時(shí)間2~3 d。

1.2.4 大生產(chǎn)(120 m3)發(fā)酵培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度分別為淀粉174~178 g/L，熱軋黃豆餅粉28~32 g/L，酵母粉10 g/L，玉米漿2 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%。消后體積92~94 m3，接種量：6~8 m3。

搖瓶培養(yǎng)條件：溫度27~28℃，攪拌頻率35~48 Hz，風(fēng)量2 600~3 100 m3/h，培養(yǎng)時(shí)間14~16 d。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生物量測(cè)定

精確量取50 mL發(fā)酵液加入至250 mL三角瓶中，再添加適量助濾劑。于水浴鍋中升溫至約95℃，維持3~5 min，抽濾得濾餅，適量熱水洗，102℃烘干到恒重，降溫稱量(W2)，生物質(zhì)量濃度的計(jì)算公式為：

式中：20為換算系數(shù)，W1為助濾劑質(zhì)量，W0為濾布質(zhì)量。

1.3.2 B1a效價(jià)測(cè)定

精確量取2 mL發(fā)酵液，加入到50 mL容量瓶中，添加適量甲醇至規(guī)定位置，超聲浸取10~20 min，甲醇定容、過濾待用。

HPLC系統(tǒng)：色譜柱C18(4.6 mm×250 mm)，柱溫30℃，流動(dòng)相甲醇∶水=9∶1(體積比)，流速1.0 mL/min，測(cè)量用波長(zhǎng)246 nm，進(jìn)樣量20 μL，記錄測(cè)量的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算B1a效價(jià)的公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵效價(jià)、生物量

阿維菌素是典型的菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成非偶聯(lián)型發(fā)酵的產(chǎn)物[4]。作為一種次級(jí)代謝物，其產(chǎn)素時(shí)間和產(chǎn)素速率對(duì)合成反應(yīng)時(shí)的環(huán)境高度敏感，當(dāng)阿維鏈霉菌菌體濃度較高時(shí)，發(fā)酵液黏度明顯增加，這有別于細(xì)菌的發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)化生產(chǎn)的反應(yīng)器容積大小不同，控制參數(shù)有區(qū)別。長(zhǎng)期觀察2種發(fā)酵過程發(fā)現(xiàn)，工業(yè)化生產(chǎn)狀態(tài)下的效價(jià)和生物量均低于其實(shí)驗(yàn)室水平。圖1數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)室50 L發(fā)酵狀態(tài)下，發(fā)酵效價(jià)增長(zhǎng)迅速，放罐時(shí)效價(jià)和生物量分別達(dá)8 327μg/mL和53.6 g/L；而工業(yè)化生產(chǎn)狀態(tài)下，放罐時(shí)效價(jià)和生物量?jī)H分別為7 136μg/mL和47.2 g/L(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵效價(jià)與生物量

提高發(fā)酵效價(jià)的途徑，首先是構(gòu)建高產(chǎn)菌株，增加單位體積菌株的B1a合成能力；其次，通過對(duì)發(fā)酵過程的代謝調(diào)控，如通過補(bǔ)料等延緩菌體衰老以提高合成速率和延長(zhǎng)阿維鏈霉菌的產(chǎn)抗時(shí)間，進(jìn)而提高發(fā)酵放罐效價(jià)；再次，菌株產(chǎn)能一定的情況下，通過增加單位菌體的數(shù)量，進(jìn)而提高發(fā)酵效價(jià)，也不失為一種提高發(fā)酵效價(jià)的途徑。

2.2 發(fā)酵配方

2.2.1 發(fā)酵配方的優(yōu)化

作為生物參數(shù)，生物量同黏度、pH等理化參數(shù)一樣，與培養(yǎng)基配方密切相關(guān)，并對(duì)發(fā)酵效價(jià)有重要影響。阿維菌素發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)15 d，發(fā)酵配方中碳源含量相對(duì)較高，淀粉主要作為能量物質(zhì)為阿維鏈霉菌中后期生物合成阿維菌素提供能量，而氮源主要用于構(gòu)成菌體的細(xì)胞物質(zhì)，對(duì)生物量有更大影響[5]。生物量增加，需要增加氮源，同時(shí)，與之對(duì)應(yīng)的碳源數(shù)量也需調(diào)整。為此，對(duì)黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉和淀粉4個(gè)因素按表1設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)(表2)，確定最優(yōu)水平組合。結(jié)果顯示，在設(shè)計(jì)水平內(nèi)，根據(jù)k值大小，最優(yōu)水平組合為A3B3C1D1，即氮源分別為黃豆餅粉32 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿2 g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)碳源淀粉的質(zhì)量濃度為178 g/L。根據(jù)極差(R)大小，4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響的大小順序?yàn)榈矸郏军S豆餅粉＞酵母粉＞玉米漿。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)方案不在試驗(yàn)序列中，需將優(yōu)化后的方案A3B3C1D1與第8號(hào)A3B2C1D3試驗(yàn)做搖瓶發(fā)酵對(duì)照比較。將培養(yǎng)好的種子液接入不同配方的試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組接3瓶。結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)為試驗(yàn)組效價(jià)=(8 536±179)μg/mL，對(duì)照組效價(jià)=(8 227±213)μg/mL，試驗(yàn)組較對(duì)照組高3.8%，且發(fā)酵效價(jià)波動(dòng)小，即試驗(yàn)得到的配方為最優(yōu)方案。2種方案盡管碳源、氮源總量均相同，但與第8號(hào)試驗(yàn)相比，最優(yōu)方案的玉米漿數(shù)量少，黃豆餅粉數(shù)量多，說明玉米漿在發(fā)酵配方中添加量不宜過多。玉米漿富含氨基酸，更多的以速效氮源的形式體現(xiàn)，添加量過多時(shí)，容易引起菌絲“瘋長(zhǎng)”，發(fā)酵液黏度高，影響氧的傳遞，進(jìn)而影響到初級(jí)代謝向次級(jí)代謝轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，延長(zhǎng)穩(wěn)定期，縮短產(chǎn)素期，最終影響放瓶效價(jià)。

2.3 控制參數(shù)的優(yōu)化

了解和掌握發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵過程的影響，以及微生物代謝過程的變化規(guī)律，可以有效地控制微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成，提高發(fā)酵生產(chǎn)水平。微生物發(fā)酵體系是個(gè)復(fù)雜的多相共存動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，此系統(tǒng)中，微生物細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行著上千種不同的生化反應(yīng)，它們之間既相互促進(jìn)，又相互制約，任何培養(yǎng)條件的微小變化都有可能對(duì)發(fā)酵的生產(chǎn)能力產(chǎn)生較大影響。當(dāng)培養(yǎng)基濃度增加時(shí)，除了生物量增加外，還會(huì)因細(xì)胞中原生質(zhì)飽滿，引起菌絲剛性增加，導(dǎo)致發(fā)酵液流變特性的變化[6]。即發(fā)酵液黏度增加，進(jìn)而影響質(zhì)量和能量傳遞，為此，有必要對(duì)攪拌頻率和風(fēng)量調(diào)整優(yōu)化。以放罐效價(jià)為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)比較關(guān)鍵的時(shí)間段(100 h之前)攪拌頻率和風(fēng)量設(shè)計(jì)了雙因素有重復(fù)試驗(yàn)(表3)。結(jié)果顯示，最高效價(jià)達(dá)8 183μg/mL；當(dāng)攪拌頻率為48 Hz、風(fēng)量為3 100 m3/h時(shí)，平均發(fā)酵效價(jià)最高達(dá)8 007μg/mL，且相對(duì)于攪拌頻率45 Hz，放罐效價(jià)波動(dòng)更小。阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐表明，風(fēng)量與攪拌頻率宜協(xié)調(diào)控制。例如，發(fā)酵生產(chǎn)過程偶爾會(huì)出現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)中后期，因攪拌聯(lián)軸器故障而不能運(yùn)轉(zhuǎn)，被迫將風(fēng)量調(diào)至最大，但發(fā)酵效價(jià)的增長(zhǎng)仍較慢，放罐時(shí)效價(jià)較正常罐批低500μg/mL以上。因?yàn)閿嚢璧哪康氖窃黾訅嚎s空氣在發(fā)酵液中的滯留時(shí)間，特別是下層攪拌器主要功能是將進(jìn)入發(fā)酵罐底部的壓縮空氣分散均勻。所以，當(dāng)前發(fā)酵罐普遍使用軸向流的LIGHGTIN A315和CD-6組合式攪拌器，就是為了更好地增加壓縮空氣在發(fā)酵液中的滯留時(shí)間，以保證發(fā)酵培養(yǎng)過程溶解氧供應(yīng)[7]。

表3 雙因素有重復(fù)試驗(yàn)

為更深入研究攪拌頻率、風(fēng)量對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響，對(duì)表3數(shù)據(jù)做方差分析(表4)。結(jié)果顯示，在設(shè)計(jì)水平內(nèi)，攪拌頻率P值=0.002＜0.01，即攪拌頻率對(duì)發(fā)酵效價(jià)有非常顯著影響；風(fēng)量P值=0.014＜0.05，即風(fēng)量對(duì)發(fā)酵效價(jià)有顯著影響；攪拌頻率與風(fēng)量的交互作用P值=0.860，即交互作用對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響不顯著，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果能較好吻合生產(chǎn)實(shí)踐。

表4 方差分析

2.4 工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證

菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成非偶聯(lián)型發(fā)酵產(chǎn)品，其產(chǎn)物合成速率與菌體的比生長(zhǎng)速率無直接關(guān)系，但和生物量有關(guān)[8]。微生物的生長(zhǎng)繁殖離不開各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且在一定范圍內(nèi)，基質(zhì)濃度越高，生長(zhǎng)繁殖越快，生物的質(zhì)量濃度也越高，同時(shí)合成目標(biāo)產(chǎn)物所需的條件也越苛刻。將優(yōu)化后的配方、攪拌頻率、風(fēng)量等控制參數(shù)在120 m3發(fā)酵罐上反復(fù)驗(yàn)證、對(duì)比，同時(shí)考慮能耗、生產(chǎn)穩(wěn)定性等因素，確定了主要原材料配比為黃豆餅粉32 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿2 g/L、淀粉178 g/L，100 h前攪拌頻率48 Hz、風(fēng)量3 100 m3/h。連續(xù)罐批生產(chǎn)驗(yàn)證結(jié)果(圖2)顯示，平均放罐生物量52.3 g/L，效價(jià)7 709μg/mL，較原工藝分別提高12.3%和8.0%。值得注意的是，最高效價(jià)7 968μg/mL，其生物量53.6 g/L并不是最高生物量53.8 g/L，可能與生物量的測(cè)定方法有關(guān)，本法不能消除死亡菌絲體對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。發(fā)酵培養(yǎng)過程多種偶然因素可能導(dǎo)致不同罐批，其菌體新陳代謝狀況不同，但生物量大于53 g/L罐批的平均放罐效價(jià)7 803μg/mL高于生物量為52 g/L罐批的平均放罐效價(jià)7 639μg/mL。

圖2 工業(yè)化生產(chǎn)放罐效價(jià)與生物量

3 結(jié) 論

代謝產(chǎn)物的合成是靠菌(生產(chǎn)者)來完成的。菌量越多，產(chǎn)量要越大，其條件是菌的生產(chǎn)力能保持在最佳狀態(tài)和具備適宜生產(chǎn)條件，包括產(chǎn)物合成所需的足夠基質(zhì)、前體、誘導(dǎo)物等和沒有有害代謝物積累。要滿足這些條件并不容易，因?yàn)樯锪吭黾雍?，?huì)引起菌絲形態(tài)的變化和原生質(zhì)飽滿引起的菌絲剛性的變化，這些都會(huì)對(duì)發(fā)酵液的黏度造成重大影響，進(jìn)而影響Kla。為此，必要對(duì)發(fā)酵罐攪拌系統(tǒng)重新設(shè)計(jì)，如改變攪拌器尺寸、增加攪拌器層數(shù)等，引起能耗的增加，甚至增加其他生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)于合成環(huán)境敏感的次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。而阿維鏈霉菌的發(fā)酵特性表現(xiàn)為，發(fā)酵培養(yǎng)100 h后非牛頓流體性質(zhì)減弱，料液膨脹稀化，泡沫增多，發(fā)酵液黏度減小[9]，這些都有利于高密度培養(yǎng)。

根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)狀態(tài)下阿維鏈霉菌的發(fā)酵特征，基于高密度培養(yǎng)而對(duì)發(fā)酵配方及工藝控制條件進(jìn)行優(yōu)化，平均發(fā)酵效價(jià)可提高8.0%以上，達(dá)7 709μg/mL。研究結(jié)果對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，適度實(shí)施高密度培養(yǎng)，有借鑒價(jià)值。