Survivin對(duì)食管癌細(xì)胞Tak1、NF-κB表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞周期和凋亡的影響

沙巴海提·吾斯曼，楊銀銀，劉志琴，楊嘯，李卉，劉玲

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，烏魯木齊 830017；2 新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

食管癌是全球第八大常見(jiàn)癌癥、第六大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。近十余年來(lái)，盡管我國(guó)食管癌的發(fā)病率總體呈下降趨勢(shì)，但仍高于全球平均水平，依舊是威脅我國(guó)居民健康的主要惡性腫瘤之一［2］。目前，食管癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。存活蛋白（Survivin）是凋亡抑制蛋白家族中相對(duì)分子質(zhì)量最小的成員，由142個(gè)氨基酸組成，在胞質(zhì)內(nèi)通常以二聚體形式存在，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期雙重功能［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 激活激酶1（Tak1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶家族，可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［4-5］。有研究報(bào)道，哈薩克族食管癌患者腫瘤組織Survivin 高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［6］，而Tak1 缺失會(huì)抑制MAPK、NF-κB 信號(hào)通路［7］。但Survivin 是否通過(guò)調(diào)控Tak1、NF-κB 表達(dá)，進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞周期和凋亡尚不清楚。2020年8月—2022年5月，本研究探討了Survivin對(duì)食管癌細(xì)胞Tak1、NF-κB表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞周期和凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞Eca109，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。Survivin 過(guò)表達(dá)載體及其空載體、Survivin siRNA 載體及其空載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。Survivin 抑制劑YM155，購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)、凝膠電泳儀及其配套組件，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；倒置顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon 公司；全自動(dòng)流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司。LipofectamineTM3000，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BD公司。Survivin一抗，購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；磷酸化Tak1（p-Tak1）、NF-κB p65、β-actin 一抗及山羊抗兔或鼠IgG 二抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的Eca109細(xì)胞置于37 ℃水浴中快速解凍，然后接種于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Eca109 細(xì)胞，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至細(xì)胞貼壁。當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合50%～60%時(shí)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Survivin-siRNA 組、Survivin-siRNA 空載體組、Survivin 過(guò)表達(dá)組、Survivin 過(guò)表達(dá)空載體組、YM155 組。按LipofectamineTM3000 說(shuō)明，SurvivinsiRNA 組與Survivin-siRNA 空載體組分別轉(zhuǎn)染Survivin siRNA 載體、Survivin siRNA 空載體，Survivin過(guò)表達(dá)組與Survivin 過(guò)表達(dá)空載體組分別轉(zhuǎn)染Survivin 過(guò)表達(dá)載體、Survivin 過(guò)表達(dá)空載體。空白對(duì)照組不予轉(zhuǎn)染，YM155 組加入Survivin 抑制劑YM155。

1.4 Survivin、p-Tak1、NF-κ B p65 表達(dá)檢測(cè)Survivin-siRNA 組、Survivin-siRNA 空載體組、Survivin 過(guò)表達(dá)組、Survivin 過(guò)表達(dá)空載體組轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 收集細(xì)胞，YM155 組和空白對(duì)照組同期收集細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度至5×106個(gè)/mL。取各組細(xì)胞懸液5 mL，加入含PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱變性10 min。取變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5% BSA 或脫脂奶粉封閉，然后分別加Survivin、p-Tak1、NF-κB p65、β-actin 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入山羊抗兔或鼠IgG 二抗，室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)顯影、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集各組細(xì)胞約1×106個(gè)，1 000 r/min離心10 min、離心半徑21 cm，棄上清，留取沉淀。向沉淀中加入預(yù)冷75%乙醇，4 ℃固定4 h。然后加入RNase 200 μL，37 ℃水浴30 min。再加入PI 染液400 μL，室溫避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞約1×106個(gè)，1 000 r/min 離心10 min、離心半徑21 cm，棄上清，留取沉淀。向沉淀中加入1×Binding Buffer 300 μL 重懸，然后依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI染液5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別空白對(duì)照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過(guò)表達(dá)組Suvivin過(guò)表達(dá)空載體組YM155組NF-κB p65 0.73 ± 0.40 0.54 ± 0.40 0.69 ± 0.41 0.75 ± 0.40 0.63 ± 0.44 0.45 ± 0.28 Survivin 0.76 ± 0.03 0.13 ± 0.03*0.75 ± 0.02 4.05 ± 0.27*0.61 ± 0.24 0.39 ± 0.04*p-Tak1 0.55 ± 0.16 0.68 ± 0.16 0.67 ± 0.58 0.68 ± 0.42 0.75 ± 0.40 0.77 ± 0.45

2.2 各組細(xì)胞周期分布比較 見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞周期分布比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞周期分布比較（%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞周期S期34.28 ± 1.56 33.05 ± 0.11 33.39 ± 0.91 33.30 ± 2.70 33.55 ± 0.55 31.18 ± 1.08*G1期54.11 ± 1.65 54.54 ± 0.20 51.29 ± 0.92 55.72 ± 4.52 51.22 ± 0.83 53.10 ± 0.71 G2期空白對(duì)照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過(guò)表達(dá)組Suvivin過(guò)表達(dá)空載體組YM155組11.61 ± 0.42 12.41 ± 0.22 15.33 ± 0.02 10.98 ± 1.93 15.23 ± 0.62 15.72 ± 1.03*

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別空白對(duì)照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過(guò)表達(dá)組Suvivin過(guò)表達(dá)空載體組YM155組總凋亡率19.67 ± 1.66 51.70 ± 2.16*21.23 ± 3.41 20.80 ± 2.48 20.90 ± 3.52 29.80 ± 4.01晚期凋亡率8.67 ± 0.55 22.33 ± 4.50 10.83 ± 1.93 12.43 ± 1.50 10.63 ± 2.12 18.10 ± 2.43早期凋亡率11.00 ± 2.02 29.37 ± 2.43*10.40 ± 1.73 8.37 ± 1.80 10.27 ± 1.54 11.70 ± 1.59

3 討論

食管癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要病理類(lèi)型包括鱗癌、腺癌及其他少見(jiàn)類(lèi)型。在我國(guó)90%以上食管癌為鱗癌。目前，食管癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近年研究主要集中于食管癌發(fā)病的分子機(jī)制以及早期預(yù)防［8-10］。本課題組前期篩選了食管癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步探究了表觀遺傳學(xué)中DNA 甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響［11］。Survivin 即是本課題組篩選出來(lái)的哈薩克族食管癌患者腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)基因，但其是否通過(guò)調(diào)控Tak1、NF-κB表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期分布及凋亡尚不清楚。

在惡性腫瘤中凋亡調(diào)控系統(tǒng)的分子改變分為三類(lèi)：第一類(lèi)為核心抗凋亡基因的上調(diào)，第二類(lèi)為核心促凋亡基因的下調(diào)，第三類(lèi)為參與核心凋亡調(diào)控系統(tǒng)的上游信號(hào)通路紊亂［12］。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，兼有第一、三類(lèi)凋亡調(diào)控系統(tǒng)分子的特征［13］。Survivin在正常組織中幾乎不表達(dá)，但在腫瘤組織中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與腫瘤惡性程度密切相關(guān)。Survivin 有可能是惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物［14］。Tak1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可被許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和微生物及其產(chǎn)物所激活［15］。有研究表明，在腫瘤中條件性敲除Tak1 基因，在某些情況下具有抑制腫瘤作用，Tak1 抑制劑能夠抑制NF-κB、p38 MAPK、ERK、STAT3 激活，從而抑制骨髓瘤生長(zhǎng)［16］。有研究還發(fā)現(xiàn)，敲除Tak1后，食管癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)［17］。結(jié)果表明，Tak1 在不同腫瘤中所起的作用不同。NF-κB是一個(gè)高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠參與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 還可參與腫瘤發(fā)生和DNA 修復(fù)過(guò)程。在許多惡性腫瘤中，NF-κB 以細(xì)胞類(lèi)型特異的方式發(fā)揮作用，即激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)生存基因和腫瘤微環(huán)境中炎癥促進(jìn)基因的表達(dá)，可作為腫瘤治療和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物［18］。在許多惡性腫瘤中已檢測(cè)到NF-κB的異常激活，如結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌。在乳腺癌中激活NF-κB 可抵抗細(xì)胞凋亡，并與化療耐藥有關(guān)，提示NF-κB 有可能是惡性腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，TAB3 通過(guò)Tak1-TAB3-TRAF6 復(fù)合物的形成激活NF-κB 通路，從而調(diào)節(jié)Survivin 表達(dá)［19］。也有研究報(bào)道，靶向Cripto-1/Tak1/NF-κB/Survivin 信號(hào)通路可能是對(duì)抗惡性腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗的有效途徑［20］。這些研究無(wú)疑為探索食管癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族食管癌患者腫瘤組織Survivin 高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［6］。但Survivin 是否通過(guò)調(diào)控Tak1、NF-κB表達(dá)，進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞周期和凋亡尚不清楚。為進(jìn)一步探討食管癌細(xì)胞Survivin、Tak1、NF-κB表達(dá)的關(guān)系，本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)Survivin、沉默表達(dá)Survivin 以及加入Survivin 抑制劑來(lái)觀察Eca109 細(xì)胞Survivin 表達(dá)變化，成功構(gòu)建了Eca109細(xì)胞Survivin 高表達(dá)與低表達(dá)模型。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了Tak1、NF-κB表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin表達(dá)變化并未引起Tak1、NF-κB 表達(dá)變化，提示Survivin可能不直接調(diào)控Tak1、NF-κB表達(dá)。但Survivin表達(dá)變化卻能在Eca109 細(xì)胞周期分布和凋亡調(diào)控方面發(fā)揮一定作用。YM155 抑制Survivin 表達(dá)后，Eca109 細(xì)胞G2期細(xì)胞所占比例顯著升高，S 期細(xì)胞所占比例顯著降低，說(shuō)明抑制Survivin 表達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞DNA 合成。siRNA 抑制Survivin 表達(dá)能夠使Eca109 細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率顯著升高，說(shuō)明抑制Survivin 表達(dá)能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明，Survivin可參與食管癌細(xì)胞周期分布和凋亡調(diào)控。

綜上所述，Survivin表達(dá)能夠參與食管癌細(xì)胞周期分布和凋亡調(diào)控，但其作用途徑并非通過(guò)調(diào)控Tak1、NF-κB表達(dá)實(shí)現(xiàn)。