納米銀和乙烯利預(yù)處理調(diào)控伊藤牡丹‘巴茨拉’切花瓶插品質(zhì)

史國安 王 依,2 史 田,3 高雙成 趙 淵 尚申申 胡思源

(1.河南科技大學(xué)牡丹學(xué)院洛陽市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 洛陽 471023； 2.鄭州安圖生物工程股份有限公司 鄭州 450000； 3.洛陽國家牡丹園 洛陽 471011)

伊藤牡丹最初是由日本人伊藤東一通過芍藥組(Sect.Paeonia)與牡丹組(Sect.Moutan)遠(yuǎn)緣雜交選育出的組間類型(Intersecitional peony group，Itoh groups/peonies)(Smith, 2001)。目前，國內(nèi)外有200多個(gè)伊藤牡丹品種，綜合性狀表現(xiàn)良好且運(yùn)用到生產(chǎn)中的有50多個(gè)品種(孫菊芳等， 2007； 吳國新等， 2011)?！痛睦撂倌档は盗衅贩N，株形優(yōu)美，長勢旺盛，花大色艷，花瓣亮黃，花色奇特，氣味芳香，抗逆性強(qiáng)，具有極高的觀賞價(jià)值，近年來國內(nèi)大量引種栽培(馬翔龍等， 2018)，用于公園露地觀賞、小區(qū)綠化美化和鮮切花等生產(chǎn)領(lǐng)域。但是，‘巴茨拉’切花吸水開放迅速，快速落瓣(趙丹陽等， 2017)，屬于短壽命切花類型(王依等， 2021)。隨著對牡丹高品質(zhì)切花產(chǎn)品需求量的不斷增加，需要適宜的采后技術(shù)來提高切花的瓶插壽命和品質(zhì)(Costaetal.， 2020)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年5月2日上午7點(diǎn)，伊藤牡丹切花品種‘巴茨拉’采自河南省洛陽千卉谷農(nóng)業(yè)有限公司。切取長勢一致且均處于綻口期(Ⅱ級(jí))的花枝，放置于帶有冰袋的泡沫箱中，加以保濕并立即運(yùn)回河南科技大學(xué)洛陽市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)處理

花枝基部置于蒸餾水中重新進(jìn)行水切，并保留長度25cm，2片復(fù)葉。隨機(jī)均分為4組，每組50枝，分別置于蒸餾水(對照，Control)、20 μg·mL-1納米銀(nano silver，NS)、5 μL·mL-1乙烯利(CEPA5)和20 μL·mL-1乙烯利(CEPA20)中預(yù)處理1 h，然后蒸餾水單枝瓶插。自瓶插起，于0、3、6、12、24、48、72、84、96、108和120 h觀察花枝形態(tài)和測定各生理指標(biāo)，記錄花朵開放、花枝變化特征。室內(nèi)瓶插條件均控制在溫度23～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2s-1(室內(nèi)散射光加日光燈補(bǔ)光)，光照周期為12 h/12 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花枝形態(tài)指標(biāo) 自瓶插0 h起，記錄花朵開放狀態(tài)，分別記為Ⅱ(綻口期)、Ⅲ(初開期)、Ⅳ(半開期)、Ⅴ(盛開期)、Ⅵ(始衰期)和Ⅶ(落瓣期)； 定時(shí)用數(shù)顯卡尺測量花朵直徑，統(tǒng)計(jì)花徑變化率和最大花徑； 分別統(tǒng)計(jì)切花瓶插壽命和最佳觀賞期(王凱軒等， 2020)。

1.3.2 花枝水分狀況 采用稱重法(郭聞文等， 2004; 史國安等， 2010)測量花枝吸水量、失水量和花枝鮮樣質(zhì)量，水分平衡值為花枝吸水量與失水量之差。

1.3.3 花瓣MDA和可溶性蛋白質(zhì)含量 分別用硫代巴比妥酸法和考馬斯亮藍(lán)法測定花瓣丙二醛(MDA)和可溶性蛋白質(zhì)含量(趙世杰等， 2002)。

1.3.4 花瓣乙烯代謝 利用氣相色譜儀同步測定花瓣乙烯釋放速率和呼吸速率(史國安等， 2011)?；ò闍CC含量、ACS和ACO活性亦采用氣相色譜法(王哲等， 2014)。

1.3.5 花瓣能量代謝 花瓣呼吸底物蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖含量，采用高效液相色譜法測定(史國安等， 2009； 王凱軒等， 2020； 王依等， 2021)。己糖含量為葡萄糖、果糖和甘露糖含量之和。

花瓣腺苷酸(ATP、ADP和AMP)含量，用高效液相色譜法測定(王凱軒等， 2020； 王依等， 2021)。能荷(EC)=([ATP]+0.5[ADP])/(ATP+ADP+AMP)。

花瓣呼吸代謝關(guān)鍵酶琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素氧化酶(CCO)、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性，分別采用北京索萊寶生物科技有限公司(SDH、CCO)和南京建成生物工程研究所(H+-ATPase和Ca2+-ATPase)超微量試劑盒按操作說明進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 Microsoft Office 2016 進(jìn)行作圖分析，IBM SPSS Statistics 20 軟件進(jìn)行差異顯著性分析(鄧肯氏法，P< 0.05)。

2 結(jié)果分析

2.1 ‘巴茨拉’切花開放衰老特征與瓶插品質(zhì)變化

由圖1可知，‘巴茨拉’切花瓶插期間，花朵發(fā)育等級(jí)由Ⅱ級(jí)露色期迅速吸水開放，12 h達(dá)到初開期，24 h接近Ⅴ級(jí)盛開狀態(tài)，高濃度乙烯利促進(jìn)花朵開放，其他處理之間差異不顯著； 對照和納米銀處理84 h花瓣開始出現(xiàn)輕度失水，納米銀延緩花瓣衰老，而乙烯利處理加速花瓣衰老。20 μL·L-1乙烯利預(yù)處理促進(jìn)花朵衰老的效應(yīng)顯著高于低劑量，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，瓶插76 h 第1朵花出現(xiàn)落瓣(圖2)?；ò昝撀涫恰痛睦谢ㄋダ系母咎卣?。與對照相比，納米銀處理顯著延長瓶插壽命和最大花徑； 乙烯利處理降低瓶插壽命、最佳觀賞期和最大花徑，加速花瓣脫落的劑量效應(yīng)差異顯著(表1)。以上結(jié)果表明，調(diào)控乙烯代謝途徑是‘巴茨拉’切花保鮮的重要技術(shù)路線。

圖1 ‘巴茨拉’切花開放和衰老等級(jí)的變化Fig.1 Index change of opening and senescence stages of ‘Bartzella’ cutflower in vaseCK:對照Control;NS:納米銀Nano silver;CEPA5:5 μl·mL-1乙烯利Ethephon；CEPA20：20 μl·mL-1乙烯利Ethephon。下同。The same below.

2.2 ‘巴茨拉’切花花枝水分狀況變化

由圖3可知，‘巴茨拉’切花瓶插是快速吸水開放過程，花枝鮮樣質(zhì)量和水分平衡值是反映其水分狀況的重要指標(biāo)。瓶插初期0～12 h花枝吸水開放，瓶插24 h 花朵開放等級(jí)接近盛開狀態(tài)，花枝相對鮮樣質(zhì)量持續(xù)升高，對照和乙烯利預(yù)處理48 h 達(dá)到峰值，納米銀處理72 h達(dá)到峰值，而后持續(xù)下降。水分平衡值均在12 h達(dá)峰值，納米銀推遲花枝水分平衡值達(dá)到0 值的時(shí)間，而乙烯利則加速達(dá)到0值的時(shí)間。納米銀預(yù)處理顯著促進(jìn)花朵直徑增大，乙烯利預(yù)處理與對照沒有顯著差異。以上結(jié)果說明，納米銀預(yù)處理能夠改善切花的水分狀況，而乙烯利的生理作用則相反。

圖2 ‘巴茨拉’切花出現(xiàn)落瓣時(shí)的效果圖Fig.2 Effect drawing of initiate petal abscission of ‘Bartzella’ cut flower

圖3 切花鮮樣質(zhì)量和水分平衡值的變化Fig.3 Changes of fresh mass and water balance value of cut tree peony flowers during vase periods

2.3 花瓣可溶性蛋白質(zhì)和MDA含量變化

花瓣可溶性蛋白質(zhì)和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量是反映切花衰老變化的重要指標(biāo)。瓶插過程中花瓣可溶性蛋白質(zhì)含量，呈現(xiàn)初期迅速升高而后持續(xù)下降的趨勢，瓶插12 h 可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到峰值，NS預(yù)處理較對照顯著升高7.65%(P<0.05)，而CEPA5預(yù)處理和CEPA20預(yù)處理較對照分別降低7.04%和11.78%(P<0.05)； 瓶插后期84 h，NS預(yù)處理較對照顯著升高7.23%，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照分別降低7.02%和28.34%。瓶插初期隨著花朵開放MDA含量快速升高，而后略有下降再緩慢升高，后期則快速增加，瓶插84 h，NS預(yù)處理較對照顯著降低11.84%(P<0.05)，而CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照分別增加20.30%和39.53%。以上結(jié)果說明，納米銀預(yù)處理能夠延緩‘巴茨拉’切花的衰老進(jìn)程，而乙烯利則加快花瓣的衰老進(jìn)程。

圖4 花瓣可溶性蛋白質(zhì)和MDA含量的變化Fig.4 Content changes of soluble protein and MDA in petals of cut tree peony flowers during vase periods

圖5 花瓣乙烯釋放量、ACC含量、ACS和ACO活性的變化Fig.5 Changes of ethylene production rate, ACC content, ACS and ACO activity of cut tree peony flowers during vase periods

2.4 ‘巴茨拉’切花乙烯代謝的變化

由圖5可知，‘巴茨拉’瓶插期間有一個(gè)明顯的乙烯躍變峰。CK、NS、CEPA5和CEPA20各預(yù)處理均在瓶插6 h出現(xiàn)較為明顯的乙烯峰值，NS預(yù)處理較對照峰值降低26.5%，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較CK分別升高19.0%和125.5%(P<0.05)，說明‘巴茨拉’切花對外源乙烯極為敏感，NS預(yù)處理能夠一定程度降低內(nèi)源乙烯的釋放，而外源高濃度CEPA預(yù)處理則顯著促進(jìn)內(nèi)源乙烯的釋放。ACC為乙烯合成的直接前體物質(zhì)，瓶插初期0～12 h ACC含量迅速降低，瓶插12 h NS預(yù)處理較對照峰值降低5.95%，CEPA5和CEPA20 預(yù)處理分別比對照升高9.68%和14.03%(P<0.05)，而后逐漸恢復(fù)呈現(xiàn)明顯的V字變化。ACS活性呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的變化趨勢，瓶插12 h ACS活性達(dá)到峰值，瓶插24 h NS預(yù)處理較對照降低9.29%(P<0.05)，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照升高10.42%和23.37%。而花瓣中ACO活性在衰老過程中呈快速下降再升高，至峰值后繼續(xù)下降的變化趨勢，瓶插48 h到達(dá)最高值，NS預(yù)處理較對照降低5.63%，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照升高28.64%和36.31%(P<0.05)。以上結(jié)果說明，納米銀預(yù)處理能夠抑制乙烯的生物合成，乙烯利則加速乙烯合成并且有明顯的劑量效應(yīng)。

2.5 花瓣糖含量和能量狀態(tài)變化

由圖6可知，‘巴茨拉’花瓣中可溶性糖主要測得蔗糖、葡萄糖和果糖，甘露糖含量較少。瓶插0～12 h花瓣內(nèi)蔗糖含量持續(xù)下降出現(xiàn)一個(gè)較低值，NS預(yù)處理較對照顯著升高12.73%(P<0.05)，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照分別降低21.58%和35.27%； 隨花朵達(dá)到盛開期蔗糖含量升至最高值，之后伴隨花朵衰老蔗糖含量逐漸降至較低水平。己糖(葡萄糖、果糖、甘露糖之和)含量在瓶插初期略有下降，隨著花朵開花迅速回升之后維持在較高水平，瓶插24 h NS預(yù)處理較對照顯著升高8.50%，CEPA5和CEPA20預(yù)處理較對照分別降低16.54%和28.68%。‘巴茨拉’切花瓶插初期0～24 h 花瓣ATP含量和能荷水平均迅速升高，峰值分別出現(xiàn)在瓶插12 h和24 h，花朵開放后兩者均持續(xù)下降。以上結(jié)果表明，納米銀預(yù)處理有利于維持較高的己糖和能荷水平，乙烯利則加速己糖消耗和維持較低的能荷水平。

圖6 花瓣糖含量和能量狀態(tài)變化Fig.6 Changes of sugars content and energy level in petals of cut tree peony flowers during vase periods

2.6 花瓣呼吸代謝關(guān)鍵酶活性變化

SDH、CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase是線粒體三羧酸循環(huán)和呼吸鏈上，細(xì)胞能量合成與轉(zhuǎn)換的4個(gè)關(guān)鍵酶。由圖7可知，瓶插期間SDH呈現(xiàn)持續(xù)下降狀態(tài)，48 h 后僅CEPA20預(yù)處理SDH活性顯著低于對照，降幅達(dá)24.85%(P<0.05)； 而在96 h 后NS預(yù)處理顯著高于對照，升幅達(dá)132.69%。瓶插期間CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性呈現(xiàn)初期隨著花朵開放而快速升高，其中瓶插6 h 納米銀和乙烯利預(yù)處理CCO和H+-ATPas活性比對照有不同程度的升高，均在12 h 出現(xiàn)峰值，NS預(yù)處理3個(gè)酶活性比對照分別升高9.84%、9.60%和14.44%，CEPA5預(yù)處理3個(gè)酶活性比對照分別下降14.40%、10.84%和5.08%，CEPA20預(yù)處理3個(gè)酶活性比對照分別下降24.14%、20.91%和17.42%(P<0.05)。以上結(jié)果說明，納米銀和乙烯利預(yù)處理能夠調(diào)控‘巴茨拉’切花瓶插期間能量代謝，兩者的生理作用相反。

圖7 花瓣SDH、CCO和ATP酶活性的變化Fig.7 Changes of SDH, CCO and ATPase activities in petal of cut tree peony flowers during vase periods

2.7 ‘巴茨拉’切花生理生化指標(biāo)的主成分分析

將測定的與‘巴茨拉’切花瓶插開放衰老相關(guān)的23個(gè)重要指標(biāo)，包括水分基礎(chǔ)代謝(花徑FD、鮮樣質(zhì)量FM、花徑變化率FDR、水分平衡值WB、可溶性蛋白質(zhì)含量SP、丙二醛含量MDA)，乙烯代謝(乙烯釋放速率Eth、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸含量ACC、ACC合成酶活性ACS、ACC氧化酶活性ACO)，能量狀態(tài)(能荷水平EC、ATP含量、ADP含量和AMP含量)，呼吸基質(zhì)(蔗糖S、葡萄糖G、果糖F、甘露糖M)，呼吸代謝(琥珀酸脫氫酶活性SDH、細(xì)胞色素C氧化酶活性CCO、H+-ATPase活性 HA、Ca2+-ATPase活性 CA和呼吸速率R)進(jìn)行主成分分析(表2)，以判定各指標(biāo)在‘巴茨拉’切花開放衰老過程中的貢獻(xiàn)大小。

CK組前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.84%，基本上能夠代表‘巴茨拉’切花瓶插期間的代謝狀況。第1、第2、第3 主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為56.95%、74.54%和85.84%。第1 主成分R和SDH得分最高，其次是ACS和SP，這些指標(biāo)切花花瓣呼吸、乙烯代謝與基礎(chǔ)代謝狀況的關(guān)鍵指標(biāo)； 第2 主成分中FM、CCO和ATP得分相對較高，表明它們是水分基礎(chǔ)和能量相關(guān)代謝的重要指標(biāo)； 第3 主成分中EC和ACO得分相對較高，是反映糖、能量水平和乙烯代謝的補(bǔ)充指標(biāo)。經(jīng)NS預(yù)處理后，花瓣內(nèi)的生理機(jī)制發(fā)生顯著變化，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.83%，第1 主成分是R得分最高，其次是ACS和SDH，表明呼吸與乙烯代謝是調(diào)控‘巴茨拉’切花衰老的關(guān)鍵指標(biāo)； 第2 主成分CCO得分較高，其次是FM和WB，表明這些指標(biāo)是呼吸和水分基礎(chǔ)代謝的重要指標(biāo)； 第3 主成分ACO和EC得分相對較高，表明這些是乙烯代謝和能量水平的補(bǔ)充指標(biāo)。CEPA5預(yù)處理組，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)87.07%，第1 主成分得分最高的是SP、SDH和R，這3個(gè)指標(biāo)是切花花瓣基礎(chǔ)和呼吸代謝狀況的關(guān)鍵指標(biāo)； 第2 主成分中CCO、FM和ACS得分相對較高； 第3 主成分中HA、EC和G得分相對較高，表明這些指標(biāo)是反映了呼吸代謝、能量水平和呼吸基質(zhì)水平的補(bǔ)充指標(biāo)。CEPA20預(yù)處理組，1～3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.33%，第1 主成分SP、SDH、R和ATP得分最高，是反映水分基礎(chǔ)代謝、呼吸代謝和能量水平的關(guān)鍵指標(biāo)； 第2 主成分FM、ACS和CCO得分相對較高，是反映水分基礎(chǔ)代謝、乙烯代謝和呼吸代謝的重要指標(biāo)； 第3 主成分中EC得分相對較高，其次是HA和CA，是反映能量水平和呼吸代謝的補(bǔ)充指標(biāo)。通過上述分析，各處理第1主成分中CK和NS預(yù)處理，R、SDH和ACS得分均排在前3位； CEPA5預(yù)處理第1主成分中與CK基本一致，而CEPA20預(yù)處理，第一主成分則是SP、ATP和SDH。由此說明，‘巴茨拉’切花衰老與水分供應(yīng)、乙烯代謝、呼吸代謝、基質(zhì)水平和能量狀態(tài)密切相關(guān)，經(jīng)不同納米銀和乙烯利預(yù)處理其生理生化代謝特征有明顯改變，表明通過調(diào)控花枝水分狀態(tài)、乙烯和能量代謝是調(diào)控切花開放和衰老進(jìn)程的重要途徑。

表2 ‘巴茨拉’切花瓶插過程中水分狀況、乙烯代謝、能量水平與呼吸代謝之間的主成分分析①Tab.2 Principal component analysis of water status,ethylene metabolism,energy level and respirtory metabolism of ‘Bartzella’ cut flowers in vase

3 討論

3.1 ‘巴茨拉’切花乙烯代謝及其調(diào)控效應(yīng)

3.2 ‘巴茨拉’切花能量代謝及其調(diào)控效應(yīng)

3.3 ‘巴茨拉’切花衰老生理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析

花瓣衰老的關(guān)鍵特征已有諸多研究，如激素調(diào)節(jié)(Iqbaletal.， 2017; Maetal.， 2018)、脂質(zhì)過氧化(Songetal.， 2014; Rogers, 2012; Rogeretal.， 2016; 年林可等, 2017； Costaetal.， 2020)、糖代謝(史國安等, 2009; van Doorn, 2004; Arrometal.， 2012)、程序化細(xì)胞死亡(Yamadaetal.， 2007)以及相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(van Doornetal., 2008; Shahrietal., 2014; Gaoetal.， 2016)。乙烯能夠顯著的調(diào)控氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的開度(Arveetal.， 2015)，加速植物葉片和花瓣失水，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化水平升高以及能量供應(yīng)能力的降低(王依等， 2021)，加速切花花瓣的衰老進(jìn)程(Wuetal.， 2017; Maetal.， 2018)。本研究結(jié)果表明，‘巴茨拉’切花開放和衰老過程是一個(gè)快速吸水和脂質(zhì)過氧化過程(圖2、圖3)。用納米銀和乙烯利預(yù)處理‘巴茨拉’切花，對涉及的23個(gè)生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果進(jìn)行的主成分分析表明，第一、二主成分均顯示呼吸代謝(活性速率、SDH和CCO活性)、能量狀態(tài)(ATP含量)、乙烯代謝(ACS活性)與水分狀況(可溶性蛋白質(zhì)含量和花枝鮮樣質(zhì)量)是‘巴茨拉’切花緊密關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵和重要指標(biāo)(表2)。因此，伊藤牡丹‘巴茨拉’切花保鮮技術(shù)的基礎(chǔ)依賴于有效地調(diào)控花枝水分供應(yīng)、乙烯和能量等相關(guān)生理生化代謝過程。

3.4 ‘巴茨拉’牡丹切花保鮮技術(shù)策略

對于乙烯敏感型切花，確定適宜的采收時(shí)期、適時(shí)預(yù)冷及采后抗乙烯處理是決定保鮮成效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Hashemabadi, 2014; Wangetal.， 2014; Arveetal.， 2015;Zhaoetal.， 2018; Costaetal.， 2020;Xueetal.， 2020;史國安等， 2010; 葉迪等， 2021)。抑制乙烯生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠有效地調(diào)節(jié)‘巴茨拉’切花開花衰老進(jìn)程(王依等， 2021)，選擇適宜的抗乙烯處理措施是乙烯敏感型切花保鮮技術(shù)的基本策略(Scariotaetal.， 2014)，深入研究‘巴茨拉’切花采后衰老及其信號(hào)分子應(yīng)答與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是今后重要的研究方向。

4 結(jié)論

‘巴茨拉’伊藤牡丹切花屬于乙烯超敏感類型。乙烯受體抑制劑納米銀能夠抑制乙烯生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而乙烯釋放劑乙烯利能夠加速內(nèi)源乙烯釋放，并且有明顯的劑量效應(yīng)，說明內(nèi)源乙烯是‘巴茨拉’切花致衰的關(guān)鍵因子之一。在采后調(diào)控‘巴茨拉’乙烯代謝的基礎(chǔ)上，瓶插過程兼顧維持切花花枝較好的水分狀況和提高能量供應(yīng)水平，對完善‘巴茨拉’切花保鮮技術(shù)具有重要的理論指導(dǎo)意義。