α-KGDHC酶活性及琥珀酰化修飾對缺血性腦卒中的適應性再灌注大鼠腦保護的機制研究*

陳旭 龔紹慧 余斌 詹劍

缺血性腦卒中是由于腦部血管阻塞引起腦組織缺血、缺氧，造成腦組織損傷，嚴重者對患者腦部神經功能造成嚴重的影響，主要表現(xiàn)為偏癱、語言、感覺等障礙[1-2]。降低因缺血缺氧導致的神經損傷是腦神經領域研究的熱點，目前認為線粒體在缺血性腦卒中的神經細胞恢復方面發(fā)揮重要作用，但其作用機制復雜，尚無確切定論[3]。線粒體是生物氧化及能量轉換的重要場所，其中線粒體酶系在線粒體功能的發(fā)揮中至關重要，α-酮戊二酸脫氫酶復合體（α-KGDHC）是其中重要的一員，是調節(jié)有氧代謝中的速度酶[4-5]。相關研究認為，α-KGDHC活性能夠影響腦組織的能量代謝，當其活性較低時，會造成腦組織損傷，影響腦的正常功能[6]。同樣有研究證實，α-KGDHC 對于腦組織中活性氧的濃度具有一定的調節(jié)作用[7]。α-KGDHC 能夠作為轉琥珀酰酶，發(fā)揮調節(jié)琥珀?；揎椀淖饔?，有研究表明，抑制α-KGDHC 活性能夠降低線粒體蛋白質的琥珀?；?，從而減輕缺血再灌注的組織損傷[8]。因此推測α-KGDHC 與缺血性腦卒中具有一定的聯(lián)系。目前關于α-KGDHC 酶活性及琥珀?；揎棇θ毖阅X卒中的研究較少，本研究對其影響及作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠，級別：清潔級，數(shù)量：50 只，周齡：8 周齡，體重：187～223 g，平均（203±15）g，由山西省醫(yī)科大學提供，許可證為[生產許可SCXK（晉）2019-0004]，經動物倫理委員會批準。

1.2 主要材料與儀器 3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）（CAS：1460-34-0，生產廠家：上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格：5 g）；戊巴比妥鈉（CAS：57-33-0，生產廠家：上海易匯生物科技有限公司，規(guī)格：5 g）；紅四氮唑（CAS：298-96-4，生產廠家：北京凱詩源生物科技有限公司，規(guī)格：500 g）；α-KGDHC酶聯(lián)免疫試劑盒（上海一基實業(yè)有限公司，貨號：YJ000643）；小動物動脈夾（上海玉研科學儀器有限公司，型號：Y501-08 型），小動物腦血流儀（上海玉研科學儀器有限公司，型號：LAB）；酶標儀（奧地利Infinite 公司，型號：200 Pro）；蛋白質質譜分析儀（北京百泰派克生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 從50 只雄性清潔級大鼠中隨機選取10 只作為Sham 組（僅分離頸動脈，不結扎），其余大鼠通過結扎頸動脈建立腦缺血模型。所有大鼠均進行麻醉處理（2%戊巴比妥鈉，30 mg/kg），將大鼠固定后對頸部進行消毒，沿頸部中線做一切口，分離肌肉組織后剝離出頸內、外動脈及頸總動脈，采用動脈夾將頸總動脈夾閉，并結扎頸外動脈，將尼龍線栓插入頸內動脈，當繼續(xù)插入感受到阻力時停止并固定，取下動脈夾，阻塞腦中動脈建立腦缺血模型。整個操作過程進行大鼠腦部血流量監(jiān)測，腦缺血建模成功標注：線栓插入完全后，血流量下降超過20%。

35 只大鼠腦缺血模型建立成功，并隨機分為NR 組、AR 組、NR+3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）組各9 只，AR+KMV 組8 只，各組再進行再灌注處理。

再灌注：所有大鼠缺血0.5 h 后抽出線栓，NR操作為：直接取出線栓后縫合，完全開放腦血流量，15 min 后處死，AR 操作為采用動脈夾，控制為開放1/2 腦血流量退出線栓并縫合，0.5 h 后處死。腦缺血再灌注建模成功標準：線栓取出后，腦血流量上升至基線的70%（10 min 內）。35 只大鼠均成功建立再灌注模型（術中應維持大鼠核心體溫）。

1.3.2 藥物處理 根據(jù)人與實驗動物藥物劑量換算公式[9]，NR+KMV 組、AR+KMV 組均于缺血后腹腔注射給予10 μL 的KMV（0.2 mol/L），其余組給予等量的生理鹽水。

1.3.3 大鼠腦組織α-KGDHC 活性檢測 所有大鼠麻醉處理后迅速處死，取損傷腦組織，置于液氮中冷凍保存，加入適量緩沖液，研磨成勻漿，低溫離心（5 000 r/min，15 min）收集上清液，采用α-KGDHC 酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測，加入反應混合液反應5 min，記錄340 nm 波長激發(fā)后，460 nm發(fā)射熒光的光密度值，計算α-KGDHC 活性。

1.3.4 大鼠腦梗區(qū)域占比情況 取各組凍存的腦組織，于切片模具中制作腦組織切片（2 mm），將切片置于2% 紅四氮唑溶液中染色0.5 h，染色完成后與黑色背景下拍照并觀察，采用scionimage 軟件分析計算梗死面積，白色區(qū)域為梗死面積，紫紅色為非梗死區(qū)域。腦梗區(qū)域占比=梗死體積/總體積×100%。

1.3.5 蛋白質琥珀?；兓闆r 采用免疫沉淀-質譜分析線粒體檢測蛋白質琥珀酰基表達量，各組取部分凍存腦部位，研磨成勻漿后加入裂解液，裂解腦組織、細胞，低溫下使用超聲探針進行沖擊（沖擊3 次，每次間隔15 s），離心后取上清液，置于EP 管中，加入蛋白酶抑制劑，冰上反應5 min，將蛋白質稀釋至200 μg/mL，加入稀釋好的賴氨酸琥珀?；贵w（稀釋比1∶200），再加入20 μL/mL的蛋白A 瓊脂糖磁珠，低溫孵育過夜，洗滌后進行洗脫，并對所得肽段進行LC/MS/MS 分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 利用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組α-KGDHC 活性經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Sham 組比較，NR 組α-KGDHC 活性低（P＜0.05）；與NR 組比較，AR組α-KGDHC 活性高，NR+KMV 組α-KGDHC活性低（P＜0.05）；與AR 組比較，AR+KMV 組α-KGDHC 活性低（P＜0.05）；各組腦梗區(qū)域占比經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Sham 組比較，NR 組腦梗區(qū)域占比高（P＜0.05）；與NR 組比較，AR 組腦梗區(qū)域占比低，NR+KMV組腦梗區(qū)域占比高（P＜0.05）；與AR 組比較，AR+KMV 組腦梗區(qū)域占比高（P＜0.05）；各組賴氨酸琥珀?；磉_量經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Sham 組比較，NR 組賴氨酸琥珀?；磉_量低（P＜0.05）；與NR 組比較，AR 組賴氨酸琥珀酰基高，NR+KMV 組賴氨酸琥珀?；磉_量低（P＜0.05）；與AR 組比較，AR+KMV 組賴氨酸琥珀酰基表達量低（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠腦組織α-KGDHC活性水平、腦梗區(qū)域占比及賴氨酸琥珀?；磉_量比較（）

表1 大鼠腦組織α-KGDHC活性水平、腦梗區(qū)域占比及賴氨酸琥珀?；磉_量比較（）

*與Sham 組比較，P＜0.05；#與NR 組比較，P＜0.05；△與AR 組比較，P＜0.05。

3 討論

缺血性腦卒中由于腦部血管堵塞導致腦組織缺氧缺血，即使在及時的治療下恢復血液流通，依舊會對腦組織造成一定的損傷，因此近年來學者致力于降低缺血再灌注對于腦組織的損傷[10-11]。目前認為缺血再灌注損傷是由于缺血、缺氧導致線粒體功能受損，并產生大量的氧自由基，當其濃度過高時會誘導細胞凋亡或壞死，從而導致腦組織損傷[12-13]。因此，保護線粒體功能是改善缺血再灌注的重點。α-KGDHC 是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶，而三羧酸循環(huán)是線粒體功能的重要部分，是氧自由基的生成的重要途徑[14-15]。因此α-KGDHC 活性對于改善缺血性腦卒中的適應性再灌注具有研究意義。

本研究顯示，與Sham 組比較，NR 組α-KGDHC活性及賴氨酸琥珀?；磉_量低，腦梗區(qū)域占比高，表明缺血后再灌注會降低α-KGDHC，減少琥珀?；?，腦損傷面積增加。原因為腦缺血缺氧后有氧代謝受阻，氧化磷酸化過程無法正常進行，但三羧酸循環(huán)依舊能進行，產生大量還原型輔酶，在α-KGDHC 的作用下生成H2O2，而H2O2則會反向抑制α-KGDHC 活性，導致α-KGDHC 降低[16-17]。當再灌注后，雖恢復氧供給，但三羧酸循環(huán)受損，恢復較慢，另外缺血時還會產生大量的次黃嘌呤，再灌注時，在氧的作用下生成黃嘌呤并釋放氧自由基，進一步抑制α-KGDHC 活性[18-19]。AR 則會減輕部分腦損傷，增加α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀?；揎?，表明相較于NR，AR 對于腦組織具有一定的保護作用，其作用機制可能與α-KGDHC 活性的增加有關。能夠逐步增加氧供給，使三羧酸循環(huán)逐步恢復，減少還原型輔酶的堆積，同時減少氧自由基的產生，降低對α-KGDHC 活性的抑制作用[20]。為證實AR 通過α-KGDHC 活性對腦組織的保護作用，本研究通過加入α-KGDHC 活性抑制劑KMV，結果顯示，在NR 的基礎上給予KMV 則會抑制α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀?；揎棧黾幽X梗面積，在AR 的基礎上給予KMV 同樣會抑制α-KGDHC 活性及賴氨酸琥珀?；揎?，增加腦損傷，該結論進一步證實AR 對于腦組織的保護作用與α-KGDHC 活性有關。而α-KGDHC 能夠作為轉琥珀酰酶發(fā)揮作用，當α-KGDHC 活性較高的情況下能夠促進賴氨酸琥珀?；揎?。

綜上所述，α-KGDHC 酶活性及琥珀?；揎椖軌蚋纳迫毖阅X卒中的AR 的損傷，對大鼠腦組織具有保護作用。