miR-129-3p與LPAR3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及其靶向關(guān)系研究*

賈明君,王義真,常聰穎,張銀閣

1.邢臺市第二醫(yī)院肝病一科，河北邢臺 054000;2.邢臺市第三醫(yī)院肝膽外科，河北邢臺 054000

肝癌是發(fā)生在肝臟的惡性腫瘤，與飲酒、病毒性肝炎、食用霉變食物相關(guān)，患者早期常無特殊癥狀，是我國常見的惡性腫瘤之一[1-2]。我國肝癌患者年齡為40～50歲，男性比女性多見，高發(fā)于東南沿海地區(qū)，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確[3-4]。研究表明表觀遺傳學(xué)尤其是微小RNA(miRNA)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5-6]，如miR-129家族的miR-129-5p可通過靶向鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ(CAMK4)抑制肝癌生長[7]，或可通過抑制Wnt信號通路減弱肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[8],但miR-129-3p在肝癌中的表達(dá)水平情況尚不清晰。溶血磷脂酸受體3(LPAR3)和PI3K信號通路參與多種癌癥進(jìn)展，LPAR3異常表達(dá)參與調(diào)控了卵巢癌等癌癥的耐藥性[9-10]，PI3K/AKT信號通路也參與了肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等過程[11-12]，但miR-129是否可以通過靶向調(diào)控LPAR3并影響PI3K/AKT信號通路尚不清晰。因此，本研究將通過多種肝癌細(xì)胞系分析miR-129-3p和LPAR3的表達(dá)水平，探究其靶向關(guān)系，并通過裸鼠荷瘤實驗確定miR-129-3p對腫瘤發(fā)展及PI3K/AKT信號通路的影響，為miR-129-3p在肝癌的作用提供分子機(jī)制和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人肝細(xì)胞及肝癌癌細(xì)胞株HL-7702、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

SPF級雌性裸鼠，(20±2)g，20只，購于北京科興中維生物技術(shù)有限公司[SYXK(京) 2019-0052]，18～22 ℃,濕度50%～60%，氨濃度≤20 ppm，換氣次數(shù)10～20次/小時，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周分為對照組和miR-129-3p組。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640及DMEM購于美國gibico公司，胎牛血清和青鏈霉素購于澳大利亞Ausbian公司；10 cm培養(yǎng)皿、15 mL離心管、1.5 mL EP管等試驗耗材購于美國Corning公司；miR-129-3p質(zhì)粒購于廣州Ribobio公司；miR-129-3p、LPAR3、PI3K及AKT引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成；ABI 7500 qPCR儀購于美國ABI公司；Western blot電泳儀購于美國bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1qPCR檢測細(xì)胞及組織中miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT表達(dá) 細(xì)胞采用1 mL Trizol 提取總RNA；腫瘤組織采用液氮中進(jìn)行研磨，加入1 mL Trizol 提取總RNA；嚴(yán)格按照miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并通過qPCR儀進(jìn)行表達(dá)水平檢測，所有操作在冰上進(jìn)行并避免RNA酶污染。7500 Fast系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量PCR的條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，35個循環(huán)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并提供，分別使用U6和GHAPDH分別作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT相對表達(dá)水平。見表1。

表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

續(xù)表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

1.3.2熒光報告酶實驗 MIRDB生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-129-3p在LPAR3上的結(jié)合關(guān)系，熒光素酶報告實驗驗證miR-129-3p與LPAR3基因的靶向關(guān)系，由廣州Ribobio公司構(gòu)建并提供LPAR3野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質(zhì)粒，并分別與miR-129-3p mimic或NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Dual Luciferase reporter Assay System說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值表示熒光素酶相對活性，實驗重復(fù)3次。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染條件 各組細(xì)胞培養(yǎng)條件：RPMI-1640/DMEM完全培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL )，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5% CO2，37 ℃靜置培養(yǎng)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用胰酶消化細(xì)胞后重選，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipo3000(11668-027，Invitrogen公司)說明書將NC和miR-129-3p質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6～8 h后，更換成完全培養(yǎng)基重新加入完全培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，用于后續(xù)各組實驗。

1.3.4裸鼠荷瘤實驗 將野生型人肝癌細(xì)胞HEPG2和轉(zhuǎn)染miR-129-3p的細(xì)胞調(diào)整至2×107個/毫升的細(xì)胞懸液。將所得細(xì)胞懸液以1 mL無菌注射器接種于20只裸鼠右側(cè)腋下皮下，注入細(xì)胞懸液每只裸鼠注射0.2 mL。對照組(n=10)注射野生型HEPG2細(xì)胞，miR-129-3p組裸鼠(n=10)注射轉(zhuǎn)染miR-129-3p的HEPG2細(xì)胞，7 d后測量腫瘤體積，建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):皮下瘤塊體積≥0.5 cm3，腫瘤生長達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的入組進(jìn)入后續(xù)分組及實驗，成瘤后每3天用游標(biāo)卡尺測量皮下瘤塊的長短徑，計算腫瘤體積=長徑×短徑2×1/2，連續(xù)21 d，繪制兩組裸鼠腫瘤生長曲線及每只裸鼠腫瘤生長曲線。

1.3.5Western blot 檢測蛋白表達(dá) 取適量腫瘤組織液氮下研磨，加入1 mL RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液95 ℃ 10 min煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓120 V 1.5 h，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉。加入特異性一抗LPAR3 Antibody(1∶1 000，PA5-27074，Thermer fisher，美國)，PI3K Antibody(1∶1 000，ab125633，abcam，英國)，AKT(1∶1 000，ab8805，abcam，英國)和GAPDH(1∶10 000，ab8245，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1:2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-129-3p在肝組織和癌旁組織中的表達(dá)比較 如表2所示與對照組正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402、SMMC-7721中miR-129-3p相對表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 不同細(xì)胞系中miR-129-3p 和 LPAR3相對表達(dá)水平的比較

2.2miR-129-3p與LPAR3的靶向關(guān)系確定 生物信息學(xué)軟件MIRDB預(yù)測LPAR3為miR-129-3p具有靶向關(guān)系，進(jìn)一步通過熒光報告實驗證實了在HL-7702、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 4種細(xì)胞系中miR-129-3p與LPAR3均具有靶向關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

注：A為HL-7702細(xì)胞；B為HepG2細(xì)胞；C為BEL-7402細(xì)胞；D為SMMC-7721細(xì)胞。

2.3miR-129-3p對裸鼠腫瘤生長的抑制作用 兩組裸鼠荷瘤后精神狀態(tài)均較好、活動頻繁、飲食飲水量正常。荷瘤第7天對小鼠進(jìn)行篩選，各組有10只裸鼠腫瘤體積≥0.5 cm3且大小均一，成瘤率為71%，腫瘤體積未達(dá)到實驗標(biāo)準(zhǔn)的未入組本試驗。如圖2所示，miR-129-3p組裸鼠腫瘤體生長速度顯著低于對照組，腫瘤積顯著低于對照組，由此可見腫瘤生長受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：A為腫瘤生長曲線；B為小鼠活體成像。

2.4腫瘤組織miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT的表達(dá)水平 與對照組相比，miR-129-3p相對表達(dá)水平顯著升高，LPAR3、PI3K、AKT顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 qPCR檢測腫瘤組織miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT相對表達(dá)水平

2.5腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT蛋白的相對表達(dá)水平 與對照組相比，miR-129-3p組腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT相對表達(dá)水平

3 討 論

肝癌是肝臟惡性腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性肝臟惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織，是我國高發(fā)的危害極大的惡性腫瘤；繼發(fā)性肝癌與原發(fā)性肝癌相比較較為少見，繼發(fā)性或稱轉(zhuǎn)移性肝癌系指全身多個器官起源的惡性腫瘤侵犯至肝臟，一般多見于胃、膽道、胰腺、結(jié)直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官惡性腫瘤的肝轉(zhuǎn)移[13-14]。MiRNA是多種癌癥發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控分子，尤其是參與了肝臟細(xì)胞分化和組織發(fā)育過程中的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程[15-16]。研究表明miR-129對肝臟疾病發(fā)展中具有調(diào)控作用，如miR-129-5p在非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者中顯著異常表達(dá)，并且異常表達(dá)的MiR-129-5p在NAFLD患者可能是一種潛在的診斷生物標(biāo)志物[17],也有研究通過在碳CCl4大鼠模型證實了升高的miR-129-5p可通過PEG3的NF-κB信號通路減輕肝纖維化[18]。本研究通過3種肝癌細(xì)胞系及對照細(xì)胞系證實了miR-129-3p在3種肝癌細(xì)胞中均出現(xiàn)顯著低表達(dá)，提示miR-129-3p可能對肝癌細(xì)胞具有抑制作用，因此本實驗進(jìn)行了裸鼠荷瘤實驗進(jìn)一步探究過表達(dá)miR-129-3p是否會干預(yù)肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖，結(jié)果證實轉(zhuǎn)染miR-129-3p的肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)增殖顯著降低，腫瘤生長受到顯著抑制，由此提示：miR-129-3p對肝癌的發(fā)生發(fā)展具有顯著的抑制作用。

LPAR3主要位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，編碼G蛋白耦聯(lián)受體家族以及EDG蛋白家族的一個成員。該蛋白作為溶血磷脂酸的細(xì)胞受體發(fā)揮作用，并介導(dǎo)溶血磷脂酸誘發(fā)的鈣動員。該受體主要與G(q/11)α蛋白結(jié)合可通過吸附miRNA影響基因表達(dá)，尤其可以激活RAS/MAPK和PI3K/AKT通路[10-19]。研究表明上調(diào)的miR-15b通過靶向LPAR3抑制PI3K/AKT通路，進(jìn)而緩解卵巢癌[20]，但是miR-129-3p是否可以靶向LPAR3進(jìn)而調(diào)控PI3K/AKT從而發(fā)揮抑制腫瘤作用上不明確，因此本研究首先通過生物信息學(xué)分析軟件DBmiR預(yù)測了miR-129-3p與LPAR3具有調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步在3種肝癌細(xì)胞和1種對照細(xì)胞中通過熒光報告實驗證實了miR-129-3p與LPAR3的靶向作用，由此證實在細(xì)胞水平上，miR-129-3p與LPAR3的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步在體內(nèi)實驗中證實這種靶向調(diào)控關(guān)系，本文通過裸鼠實驗，分別荷瘤野生型HepG2和轉(zhuǎn)染miR-129-3p的HepG2細(xì)胞，證實了在過表達(dá)miR129-3p的小鼠腫瘤組織中，LPAR3出現(xiàn)了顯著低表達(dá)，這與細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果一致，進(jìn)一步在體內(nèi)實驗證明了miR-129-3p與LPAR3的靶向作用。由于LPAR3可以調(diào)控PI3K/AKT信號通路活性[20-21]，本研究探究了腫瘤組織中的PI3K/AKT表達(dá)水平，結(jié)果證實低表達(dá)LPAR3會抑制PI3K和AKT的mRNA及蛋白表達(dá)水平，由此推測在肝癌細(xì)胞中，miR-129的高表達(dá)會靶向LPAR3基因，調(diào)控PI3K/AKT信號通路，實現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞學(xué)實驗和體內(nèi)裸鼠荷瘤實驗證實了miR-129-3p在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，miR-129-3p可以通過靶向LPAR3，抑制PI3K/AKT信號通路，實現(xiàn)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用。本研究可以進(jìn)一步獲取臨床樣本，探究miR-129-3p對LPAR3的靶向作用及下游信號通路的調(diào)控作用，完善miR-129-3p的調(diào)控機(jī)制和信號通路。