DsbC介導HCV優(yōu)勢抗原表位原核可溶性表達與間接ELISA分析*

肖彭瑩，黃國紅，王麗君，孫衛(wèi)國，張靈霞，侯江厚△

1.昆明市婦幼保健院婦女保健部，云南昆明 650013;2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心結(jié)核病研究所，北京 100091

丙型肝炎病毒(HCV)的抗體檢測目前仍是診斷HCV慢性感染和進行獻血員篩查的主要方法。隨著技術(shù)方法的進步，HCV抗體檢測試劑已發(fā)展到第三代，抗原主要組成為結(jié)構(gòu)區(qū)C蛋白、非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3及NS5區(qū)重組抗原，雖然檢測的靈敏度得到很大提高，但由于抗原序列包含有較多非保守性序列，導致特異度不強[1]，需要通過生物信息學的方法篩選特異度強優(yōu)勢保守抗原序列。同時HCV感染具有異質(zhì)性特點，存在不同的基因型和亞型，同一型各片段抗原性存在差異，其相應的抗體在體內(nèi)出現(xiàn)的時間、持續(xù)狀態(tài)及意義有一定的差別[2]，在進行抗原篩選時，從我國的主要基因型1b、2a 和 6a 出發(fā)，從不同HCV 基因序列不同片段中挑選優(yōu)勢的編碼抗原，是進行抗體檢測成功的關(guān)鍵。原核系統(tǒng)因為自身的缺陷，在重組外源蛋白時，存在表達量低和容易形成包涵體的缺點，二硫化物異構(gòu)酶 DsbC 作為伴侶分子，不但可以提高重組蛋白的正確折疊，促使外源蛋白可溶性形式存在，還能提高目的蛋白的表達水平和生物活性[3]。在本研究中，從HCV的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白中，通過生物信息學的方法，篩選出盡可能多并且特異度強的抗原表位，進行串聯(lián)形成抗原肽，在原核系統(tǒng)內(nèi)進行重組表達，同時以DsbC 作為融合分子進行融合表達，純化兩組蛋白，評價兩組抗原融合肽在HCV 感染者血清診斷中的靈敏度和特異度，評價 DsbC 蛋白作為伴侶分子在重組抗原血清學診斷上提高其靈敏度、特異度和生物活性中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 原核表達載體pET-DsbC、pET-28a 和宿主感受態(tài)BL21(DE3)由解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心(下稱八中心)實驗室制作保存；限制性內(nèi)切酶 NdeⅠ、HindⅢ和XhoⅠ及T4 DNA 連接酶均購自美國 NEB 公司。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 凝膠回收和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為國產(chǎn)天根生物科技公司產(chǎn)品；His標簽親和樹脂購為GE公司產(chǎn)品，自行灌裝純化柱；山羊抗人IgG(HRP標記)為索萊寶生物公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法抗體檢測試劑盒購于北京飛凱生物技術(shù)公司。100份HCV陽性血清來源于昆明市婦幼保健院和八中心血液科血清庫。100份HCV陰性血清(血液抗-HCV陰性；血液HCV RNA陰性)來源于八中心體檢中心。ELISA法嚴格按照生物安全有關(guān)規(guī)定操作，遵循實驗室操作的常規(guī)規(guī)定。

1.2方法

1.2.1HCV 優(yōu)勢抗原表位信息學篩選策略 HCV 病毒核心蛋白C、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4和NS5區(qū)擁有保守的免疫顯性區(qū)域[4]，其中HCV核衣殼蛋C與NS3蛋白在HCV多種基因型中最為保守[5]。以我國HCV主要基因型1b(GenBank:ACJ37239.1)、2a(GenBank:AGZ91309.1)、 6a(GenBank:BBH 48831.1) 型為分析對象，綜合考慮親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)，采用 Emini Surface Accessibility Prediction、Karplus & Schulz Flexibility Prediction、Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity和 Parker Hydrophilicity Prediction 等算法篩選優(yōu)勢表位，通過在線 Blast 分析序列的保守性，剔除特異度低的部分，結(jié)合文獻[6-8]，選取HCV的C蛋白和NS3蛋白的部分序列為主要骨架，加入NS4和NS5優(yōu)勢抗原肽段組成待檢測的抗原肽，在短肽之間加入GSG或者AAY進行串聯(lián)，命名為P367。序列提交北京華大基因進行合成，對應的核酸N端加入限制性酶切位點HindⅢ-NdeⅠ，C端加入終止密碼子TAA和限制性酶切位點XhoⅠ序列，合成編號為WHC2112223。

1.2.2pET-P367、pET-DsbC-P367表達載體的構(gòu)建與鑒定 將合成的克隆載體pUC-P367菌株進行擴大培養(yǎng)后，提取克隆載體，然后分別以限制性內(nèi)切酶HindⅢ與XhoⅠ、NdeⅠ與Xhol進行雙酶切，用DNA電泳凝膠回收試劑盒回收融合基因片段P367，將回收的雙酶切片段分別與對應雙酶切的表達載體pET-DsbC、pET-28a進行連接，熱激法轉(zhuǎn)化表達宿主感受態(tài)細胞BL21(DE3)，涂含有卡納抗性固體平板37 ℃隔夜培養(yǎng)，挑選灰白色光滑菌落轉(zhuǎn)接到含有50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中激活，選取陽性克隆送華大基因進行測序以確保閱讀框的正確。

1.2.3HCV P367抗原肽原核重組表達與純化 將篩選到的陽性克隆菌株pET-P367、pET-DsbC-P367接種于LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后按照1∶50的比例接種到100 mL LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)3～4 h；再按照1∶20的比例接種到1 000 mL LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)到吸光度(A600)值為0.6時，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，終濃度為0.5 mmol，37 ℃恒溫搖床震蕩誘導7 h，收集1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min。沉淀重懸于400 μL的1×SDS上樣緩沖液中，沸水浴5 min，取20 μL進行12% SDS-PAGE膠電泳。

4 ℃ 條件下以 6 000 r/min 離心收集表達菌體，1×PBS懸浮混勻冰育，置于冰水狀態(tài)下進行超聲碎菌。高速離心分離上清和沉淀，由于P367以包涵體形式存在，采用柱上復性復性的方法對P367進行純化，取包涵體以1% triton-100洗滌兩次，以7 mol尿素+PBS 充分溶解包涵體，高速離心后取上清以2 mL/min 緩慢結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱，緩慢柱流速PBS溶液進行柱上復性，以50 mmol咪唑+PBS洗脫除去雜蛋白、以120 mmol咪唑+PBS 洗脫收集復性后的融合肽 P367；取 DsbC-P367 融合蛋白表達后超聲上清，同樣以鎳離子螯合的親和層析柱進行親和純化，以80 mmol咪唑+PBS洗脫除去雜蛋白、以150 mmol咪唑+PBS洗脫收集復性后的融合肽DsbC-P367。兩組純化的樣品分別取20 μL 變性后進行12% SDS-PAGE 電泳分析融合蛋白的純度，終產(chǎn)品以水透析除去咪唑和鹽離子，冰干保存。

1.2.4DsbC-P367、P367多表位抗原融合肽抗原性Western blot分析 純化后的DsbC-P367、P367蛋白以PBS 配制成1 mg/mL的母液，各取5 μL煮沸變性，12% SDS-PAGE電泳后半干法轉(zhuǎn)移(恒壓20 V，30 min)至硝酸纖維系膜(NC膜)上。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，37 ℃條件下與1∶50稀釋HCV陰陽性血清后孵育1 h，以PBS震蕩洗膜5次，再以HRP標記的羊抗人IgG孵育1 h，同樣震蕩洗滌5次，ECL暗室自動曝光顯影分析DsbC-P367、P367蛋白的抗原性及其特異度。

1.2.5HCV兩組融合肽DsbC-P367、P367最佳包被濃度 為了驗證兩組不同融合肽在血清HCV-IgG抗體檢測的最佳包被濃度，采用濃度等比梯度對兩組重組融合肽進行稀釋，以用碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白DsbC-P367、P367稀釋為1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 μg/mL，分別取100 μL包被酶標板，37 ℃包被2 h，除去包被液，加入150 μL封閉液37 ℃封閉2 h，甩干封閉液，洗滌5次；每孔加PBS和待測稀釋血清各50 μL，每個樣品設(shè)置兩個平行孔，空白孔不加液體，37 ℃溫育30 min，洗滌5次，拍干；加入HRP標記山羊抗人IgG(1∶5 000)，37 ℃ 孵育20 min后洗滌；每孔加入底物液A和B各50 μL，輕拍混勻，37 ℃ 避光顯色10 min；加入2 mol/L H2SO4終止液50 μL進行終止反應，酶標儀450 nm波長下測定各孔A值，選用P/N 值最大 (P為標準陽性血清A450;N為標準陰性血清A450)時的條件為最佳反應條件。

1.2.6HCV兩組融合肽DsbC-P367、P367血清抗體間接ELISA差異分析 為了驗證兩組不同融合肽在血清HCV-IgG抗體檢測的差異性和可行性，采用間接ELISA實驗進行驗證。血清樣本為經(jīng)過“金標準”篩選的陰陽性血清，同時以成熟的商品化試劑盒進行比較。將DsbC-P367、P367兩種融合肽以包被緩沖液均稀釋成10 μg/mL，ELISA每孔包被100 μL。ELISA實驗步驟同方法1.2.5。

1.2.7DsbC-P367、P367間接ELISA特異度、靈敏度和符合率分析 將100份明確HCV陽性血清和100份明確HCV陰性血清以商品化HCV-IgGELISA法檢測試劑盒進行復檢，操作方法嚴格遵照說明書進行，同上述實驗同批同時操作，檢測A值，分析獲得的兩組重組蛋白用于ELISA血清抗體檢測中體現(xiàn)出的靈敏度、特異度和相對試劑盒的符合率。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析；散點圖用GraphPad Prism 5.00軟件繪制；ELISA測定的A值分布進行Wilcox檢驗；cut off值以陰性結(jié)果A值均值2.1倍作為臨界值。用McNemer檢驗及Kappa一致性檢驗評價不同檢測方法的一致性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1HCV優(yōu)勢抗原表位生物信息學分析與篩選、串聯(lián) 以我國HCV的1b、2a和6a型為分析對象，通過對其抗原優(yōu)勢表位的預測，結(jié)合BLAST保守性分析，選擇的抗原序列為：HCVC(1b) aa1～60、NS3(1b) aa1201～1301、NS4A(1b)aa1～30、NS4A(2a) aa1～30、NS5A(2a) aa2272～2331等5個抗原區(qū)域作為優(yōu)勢抗原表位組合框架，并在合成的C端補充加入NS3(1b) VDFIPVEGDPTTMR、Core(6a)PALSTGLIH、NS4A(2a)SIIGRLHINQRTVVAP、NS4B(1b)SRGNHVSPTHYVPESDA、E2(1b)YEVRNVSGVYH 5種抗原短肽，短肽之間以AAY或GSG相連。合成的序列命名為P367，核酸兩端加入相應的酶切位點和終止密碼子序列。

2.2DsbC-P367、P367融合肽表達載體的構(gòu)建與鑒定 全序列合成的克隆載體pUC-P367分別以限制性內(nèi)切酶HindⅢ與XhoⅠ、NdeⅠ與XhoⅠ進行雙酶切，UV燈下觀察片段大小，融合肽P367含有367個aa，對應核酸大小為1 100 bp(圖1)，兩組雙酶切產(chǎn)生的核酸片段大小均在1 100 bp，符合預期。將雙酶切的核酸片段P367進行膠回收后，克隆到原核表達載體pET-DsbC、pET-28上。

注：M為標志物；1為雙酶切載體pUC-P367(HindⅢ與XhoⅠ)；2為雙酶切載體pUC-P367(NdeⅠ與XhoⅠ)。

2.3HCV優(yōu)勢表位融合肽DsbC-P367、P367原核重組表達與純化 對DsbC-P367、P367兩組融合蛋白進行小樣表達，SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組蛋白在原核系統(tǒng)均獲得高效表達，相對分子質(zhì)量分別為43.0×103與65.0×103(圖2、3)，與預期一致。超聲破碎后發(fā)現(xiàn)，P367融合肽主要以包涵體形式存在，而DsbC-P367融合肽大部分以可溶形式存在超聲上清中，實驗結(jié)果符合實驗設(shè)計預期，對兩組重組蛋白分別采用包涵體柱上復性和上清親和純化，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，經(jīng)親和純化后，P367融合肽純度分別為92%；DsbC-P367融合肽純度為90%(圖4、5)，符合后續(xù)血清學抗體 ELISA 實驗要求。

注:M為低分子量蛋白標準；1為未誘導的全菌體；2為誘導P367全菌體蛋白；3為超聲破碎后上清；4為超聲破碎后沉淀。

注:M為低分子量蛋白標準；1為未誘導的全菌體；2為誘導 DsbC-P367 全菌體蛋白；3為超聲破碎后上清；4為超聲破碎后沉淀。

注:M為低分子量蛋白標準；1為復性后P367融合肽。

注:M為低分子量蛋白標準；1為親和純化后DsbC-P367融合肽。

2.4DsbC-P367、P367 融合肽抗原性 Western blot 實驗結(jié)果 純化后 DsbC-P367、P367 兩組融合肽均可與 HCV-IgG陽性血清發(fā)生特異性反應，通過Western blot 實驗初步鑒定了兩組蛋白的抗原性。實驗中以 HCV 陽性血清作為一抗，HRP 標記的山羊抗人 IgG 為二抗，暗室曝光后在 NC 膜出現(xiàn)單一的條帶，分子量同預期一致(圖 6)，陰性對照無條帶顯現(xiàn)。

注:1為P367；2、3為DsbC-P367；4為無關(guān)蛋白陰性對照。

2.5HCV 兩組融合肽DsbC-P367、P367最佳包被濃度確定 通過ELISA實驗檢測兩組不同融合肽在血清 HCV-IgG抗體檢測的最佳包被濃度，對抗原濃度進行等比梯度稀釋，實驗結(jié)果確定DsbC-P367、P367最佳包被濃度均為10 μg /m L，P/N 值最大。實驗結(jié)果見表1。

表1 DsbC-P367、P367蛋白最佳包被濃度的確定

2.6DsbC-P367、P367血清抗體間接ELISA實驗分析結(jié)果 以獲得的兩組融合肽作為包被抗原建立間接法ELISA試劑，分別對明確HCV陽性樣本和陰性樣本各100份進行檢測。參照文獻，實驗中cut off值設(shè)為陰性血清的A值均值2.1倍。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsbC-P367陽性樣本A值分布為(1.680±0.068)；P367陽性樣本A值分布為(1.574±0.047)；陰性血清樣本A值分布為(0.094±0.009)；cut off值為0.197。采用SPSS22.0統(tǒng)計分析，McNemer檢驗顯示：DsbC-P367融合肽與確定陽性樣本比較，P=1.00，Kappa=0.950；P367融合肽與確定陽性樣本比較，P=1.00，Kappa=0.910。采用商品化試劑盒檢測對樣本血清進行復檢，結(jié)果檢出陽性92份，假陽性7份，其McNemer檢驗P=1.00，Kappa=0.910。所得數(shù)據(jù)分析見圖7。

圖7 DsbC-P367與P367融合肽在HCV陽性

2.7DsbC-P367、P367間接ELISA特異度、靈敏度與符合率 間接ELISA測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsbC-P367與P367針對明確陽性血清檢出樣本數(shù)分別為96、90，其靈敏度分別為96.0%與90.0%；相對于陰性對照血清檢出的假陽性均為0，其特異度均為100.0%，提示DsbC-P367與P367兩種融合肽均可作為診斷抗原用于血清學抗體診斷。采用商品化試劑盒檢測對樣本血清進行復檢，結(jié)果檢出陽性92份，假陽性7份，所得數(shù)據(jù)分析見表2。結(jié)果表明，HCV DsbC-P367抗原融合肽在血清學檢測中靈敏度和特異度均優(yōu)于商品試劑盒，而P367抗原融合肽的檢測效果于目前市場上檢測試劑盒檢出率和靈敏度大致相當。

表2 DsbC-P367、P367特異度、靈敏度與符合率比較

3 討 論

目前直接抗病毒(DAAs)治療方法對抗HCV感染非常有效，精確診斷和實驗室快速鑒別是實現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2030年消除病毒性肝炎目標的關(guān)鍵。HCV-RNA檢測作為HCV感染臨床診斷的金標準已得到了廣泛地認可，但由于其價格昂貴，檢測時間較長，且不適用于HCV感染的初篩實驗，血清學檢測任然具有廣泛的應用價值[9]。由于HCV是一種高度異質(zhì)性的RNA病毒，不同地區(qū)不同基因型的HCV毒株，在核苷酸序列和氨基酸序列上都有很大的不同，從而會影響到相應蛋白的性質(zhì)和功能。我國HCV主要流行亞型為1b、2a和6a[10]。需要綜合考慮三種主要流行亞型的優(yōu)勢抗原表位去提高抗體檢測的敏感性，目前常用的抗體檢測試劑都使用3～6種重組抗原或合成肽，缺點是增加了非特異性而出現(xiàn)較多假陽性，這就需要通過多表位HCV診斷抗原的篩選加上除去非保守氨基酸序列來完成。

HCV核心多肽(C)抗原性較強，在HCV感染早期即可產(chǎn)生抗核心抗體[11]在各種基因型HCV中最為保守，其核心區(qū)的優(yōu)勢表位主要集中在氨基端[12]，選擇1b型N端1～60位氨基酸，基本包含了核心蛋白大部分疏水區(qū)和幾乎所有的重要表位；HCV感染者體內(nèi)抗-NS3出現(xiàn)較早并且持續(xù)時間長，NS3蛋白具有強抗原性，在能產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體[13]，選擇1b型NS3蛋白的1 201～1 301位氨基酸；早期研究發(fā)現(xiàn)，1型的NS4抗原對于2、3型抗-HCV抗體檢測缺乏敏感性[14]，在選擇抗原時加入了2a型的NS4A、NS4B；NS5a區(qū)的高免疫原區(qū)位于氨基酸殘基2182～2343的位置(162aa)[2]，通過在線Blast剔除非保守序列后選擇2 272～2 331表位氨基酸抗原。為了提高抗體檢測的靈敏度，在抗原選擇時，通過軟件結(jié)合多種篩選算法，篩選出5組優(yōu)勢抗原短肽，放置在合成序列的C端，極大提高了檢測的靈敏度。實驗室前期試驗也已經(jīng)驗證，在重組抗原中含有這5種優(yōu)勢短肽時，檢測的靈敏度從86.0%提高到92.0%。

在原核重組時，蛋白質(zhì)折疊是生物功能和重組蛋白生產(chǎn)的核心，空間結(jié)構(gòu)正確的形成是重組蛋白生物活性的保證，DsbC蛋白作為二硫鍵異構(gòu)酶，在原核重組的過程中扮演重要角色，不僅可以促進二硫鍵正確的配對，還可以讓錯誤折疊的蛋白重新異構(gòu)化形成正確的空間構(gòu)象[15]。PALENZUELA等[16]推論NS3蛋白所表現(xiàn)出的高免疫原性很可能是由構(gòu)象型表位引起。為了促使NS3區(qū)構(gòu)象型空間表位的形成和保持，在融合表達HCV抗原時，融合肽大都選擇GST或者Trx蛋白[7,17]，它們在提高抗原可溶性上可能起到一些作用，但相對于目的蛋白生物活性的提高和保持，明顯DsbC蛋白作用更為優(yōu)勢。其不僅提高了目的蛋白P367的表達量和可溶性，同時，DsbC-P367的檢測靈敏度從融合前的90.0%提高到96.0%。

研究已證實，單一結(jié)構(gòu)抗原在血清學抗體診斷上明顯靈敏度不足，檢測抗原來源于同一基因型的片段也會制約到其他基因型及不同序列HCV感染患者血清標本的檢測；不同基因型、同一基因型的不同基因亞型，甚至不同分離株之間由于基因序列的差異都存在有不同的免疫反應性，本課題通過信息學預測與篩選獲得的多個優(yōu)勢抗原表位區(qū)域結(jié)合優(yōu)勢抗原表位短肽，彌補了目前存在的靈敏度不高的問題，在特異度上相對于現(xiàn)有的試劑盒也明顯改善了很多，對100份陰性血清檢測，特異度達到100.0%。利用DsbC蛋白的伴侶分子功能，使得檢測的靈敏度從90.0%提高到96.0%，并且純化簡單，重復好，優(yōu)于商品試劑盒。