ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流在SLE患者中的作用及機(jī)制研究*

寇艷婷,朱星星,李 莉,原江水△

1.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧大連 116044；2.青島市市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266071;3.青島大學(xué)青島醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，山東青島 266073

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多器官的自身免疫性結(jié)締組織病，好發(fā)于育齡期女性。SLE患者易并發(fā)血脂代謝異常，SLE相關(guān)性的心血管系統(tǒng)疾病是SLE患者主要死亡原因之一[1-2]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ABCG1)是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由巨噬細(xì)胞廣泛表達(dá)，在促進(jìn)膽固醇和磷脂外流到高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)的過程中起關(guān)鍵作用。本研究通過檢測(cè)合并心血管并發(fā)癥SLE患者和未合并心血管合并癥的SLE患者中ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流能力(CEC)的變化，探討ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流途徑在SLE患者心血管疾病高發(fā)中可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2021年10月在青島市市立醫(yī)院(下稱本院)就診的 SLE 患者73例作為SLE組，按是否合并心血管并發(fā)癥分為合并心血管并發(fā)癥患者40例(SY組)，未合并心血管并發(fā)癥患者33例(SN組)，其中男12例，女61例，年齡16～83歲，平均(44±16)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除存在感染、腫瘤及其他自身免疫性疾病的患者。選擇同期在本院進(jìn)行健康體檢的52例體檢健康者作為對(duì)照組(HC組)。其中男23例，女29例，年齡23～81歲，平均(43±15)歲。SLE組和HC組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。標(biāo)本采集經(jīng)研究對(duì)象知情同意及本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 美國(guó)ABI熒光定量PCR循環(huán)儀；美國(guó)Invitrogen公司的TRIzol總RNA提取試劑(貨號(hào)15596-026)和Lipofectamine 3000(貨號(hào)L3000015)；中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的0.1% DEPC Water(貨號(hào)KGDN4500)和CHO-K1細(xì)胞；日本TaKaRa公司的cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)RR036B)和One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green)(貨號(hào)RR086B)；美國(guó)Corning Incorporated公司的6 well-cell culture plate(貨號(hào)3516)；英國(guó)abcam公司的膽固醇外流分析試劑盒(貨號(hào)ab196985)；美國(guó)Gibco公司的DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)C11995500BT)。

1.3方法

1.3.1pcDNA3.1(+) -ABCG1過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)在(RT-PCR)擴(kuò)增獲得ABCG1目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小1 671 bp，產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳,產(chǎn)物回收純化按試劑盒說明書進(jìn)行，將回收純化后的產(chǎn)物及 pcDNA3.1(+) 載體分別通過Hind Ⅲ、EcoR I酶切,然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，PCR鑒定重組克隆(F：5′-CCG GGG AAA GGT CTC GAA TC-3′，R：5′-CGC AGG GTT GTG GTA GGT AG-3′)，測(cè)序比對(duì)經(jīng)酶切驗(yàn)證的陽性克隆證實(shí)構(gòu)建成功。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO-K1細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)采用Lipofectamine 3000將pcDNA3.1(+) -ABCG1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，培養(yǎng)4～6 h后進(jìn)行RT-PCR鑒定，更換新鮮培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37 ℃的含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2血漿標(biāo)本的采集及準(zhǔn)備 清晨空腹靜息狀態(tài)下采集肘靜脈血，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心10 min后取上清液，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

去除ApoB血漿的制備：100 μL血漿中加入40 μL的PEG溶液(20%PEG，200 mmol/L的甘氨酸緩沖液，pH 7.4)，沉淀血漿中含有ApoB的脂蛋白。孵育20 min后，于4 ℃ 10 000 r/min離心30 min沉淀，收集含有HDLC的上清液，處理后的血漿用于后續(xù)的膽固醇外流實(shí)驗(yàn)。

1.3.3血脂水平檢測(cè) 脂代謝指標(biāo)由本院檢驗(yàn)科采用Beckman Au5821生化分析儀及相應(yīng)配套試劑盒檢測(cè)血漿三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、HDLC、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC) 、非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDLC)。non-HDLC計(jì)算公式:non-HDLC=TC-HDLC。

1.3.4膽固醇外流率測(cè)定 CHO-K1細(xì)胞和ABCG1高表達(dá)CHO-K1細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)2 h后待細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)基，將50 μL的Labeling Reagent和50 μL的Equilibration Buffer混勻后，每孔加入100 μL孵育16 h，去除上清，用200 μL培養(yǎng)基緩慢清洗細(xì)胞，分別在培養(yǎng)基中加入2.8%的去除ApoB脂蛋白的血漿孵育4 h，收集上清液，測(cè)量熒光強(qiáng)度(Ex/Em=482/515 nm)。用100 μL細(xì)胞裂解液裂解單層細(xì)胞，并用振蕩器室溫振蕩30 min，使單層細(xì)胞完全裂解，并測(cè)量裂解液的熒光強(qiáng)度(Ex/Em=482/515 nm)。膽固醇外流率=上清液熒光強(qiáng)度/(上清液熒光強(qiáng)度+裂解液熒光強(qiáng)度)×100%。

2 結(jié) 果

2.1各組基本情況及脂代謝指標(biāo) SLE組的脂代謝指標(biāo)，與HC組相比較，TG、TC、HDLC水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SLE組的LDLC、non-HDLC水平均高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。SY組的脂代謝指標(biāo)，與SN組相比較，TC、HDLC、LDLC水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG水平顯著高于SN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，non-HDLC水平顯著低于SN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 SLE組與HC組的基本情況與血脂指標(biāo)比較[M(P25～P75)或

表2 SY組與SN組的基本情況與血脂指標(biāo)比較[M(P25～P75)或

2.2膽固醇外流率分析

2.2.1各組在ABCG1/CHO-K1細(xì)胞與CHO-K1細(xì)胞中膽固醇外流率分析 HC組中，與CHO-K1細(xì)胞(21.37%±0.40%)相比較，ABCG1/CHO-K1細(xì)胞膽固醇外流率(28.49%±0.68%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,t=9.955)；SLE組中，與CHO-K1細(xì)胞(34.36%±3.12%)相比較，ABCG1/CHO-K1細(xì)胞膽固醇外流率(38.75%±2.24%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,t=2.798)；SY組中，與CHO-K1細(xì)胞(37.14%±1.05%)相比較，ABCG1/CHO-K1細(xì)胞中膽固醇外流率(40.54%±0.95%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,t=4.174)；在SN組中，與CHO-K1細(xì)胞(31.58%±0.31%)比較，ABCG1/CHO-K1細(xì)胞膽固醇外流率(36.96%±1.43%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,t=6.346)。見圖1。

注:*P<0.05。

2.2.2HC組和SLE組在CHO-K1細(xì)胞中膽固醇外流率分析 CHO-K1細(xì)胞中，與HC組(21.37%±0.40%)相比較，SLE組的膽固醇外流率(34.36%±3.12%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，t=10.032)；與SN組(31.58%±0.31%)相比較，SY組(37.14%±1.05%)膽固醇外流率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t=8.781)。見圖2。

注:*P<0.05。

2.2.3HC組和SLE組在ABCG1/CHO-K1細(xì)胞中膽固醇外流率分析 ABCG1/CHO-K1細(xì)胞中，與HC組(28.49%±1.17%)相比較，SLE組的膽固醇外流率(38.75%±2.24%)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05,t=7.265)；與SN組(36.96%±1.43%)相比較，SY組(40.54%±0.94%)膽固醇外流率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,t=3.616)。見圖3。

注:*P<0.05。

3 討 論

SLE作為一種累及多臟器、多系統(tǒng)的復(fù)雜的自身免疫性慢性結(jié)締組織疾病，SLE發(fā)病與遺傳和環(huán)境多種因素相關(guān)，中國(guó)SLE 患病率為 70/100 000，女性患病率為113/100 000[4-5]。SLE的死因呈雙峰模式，早期主要是疾病本身所致的器官衰竭和感染，晚期死因是心血管系統(tǒng)疾病，已有研究發(fā)現(xiàn)，與普通人群相比，SLE患者呈現(xiàn)出更高的心血管系統(tǒng)疾病的死亡率，其中缺血性卒中和心肌梗死的發(fā)生率是健康人群的3倍[6]。脂代謝異常與SLE心血管合并癥的發(fā)生密切相關(guān)，SLE患者中存在以TG水平升高和HDLC水平降低為主的脂質(zhì)代謝紊亂[7]。有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化患者的血脂指標(biāo)與未發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變者相比較，TG、TC、LDLC水平偏高，HDLC水平偏低[8]。眾所周知，育齡期的健康女性與年齡匹配的男性相比，患心血管疾病和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)較低。但是，在SLE女性患者中，血脂異常的特征是LDLC水平升高和HDLC水平降低，消除了健康女性觀察到的性別特異性的心血管疾病保護(hù)作用，此外過度激活促炎途徑和某些SLE藥物對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，所有這些都最終導(dǎo)致SLE患者的脂質(zhì)譜改變[9]。動(dòng)脈粥樣硬化病變者血脂譜與SLE患者血脂譜相符合，提示脂代謝紊亂與SLE合并動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)是機(jī)體清除過剩膽固醇的重要途徑，對(duì)機(jī)體維持膽固醇穩(wěn)態(tài)有重要意義。其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族介導(dǎo)的膽固醇外流是RCT途徑之一，也是RCT關(guān)鍵的限速步驟。該途徑包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)和ABCG1的活性膽固醇外流。ABCA1介導(dǎo)從巨噬細(xì)胞流出的膽固醇和磷脂分子被無脂載脂蛋白ApoA-I接受，這是HDLC主要蛋白質(zhì)部分，而ABCG1介導(dǎo)膽固醇流出至HDLC以進(jìn)一步成熟[10-11]。ABCA1和ABCG1介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)在很大程度上決定了細(xì)胞內(nèi)膽固醇生理水平。ABCG1作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，有關(guān)其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用卻一直存在爭(zhēng)議。

SLE患者產(chǎn)生大量自身抗體和免疫復(fù)合物形成，并且自身抗原失耐受，其中dsDNA抗體可識(shí)別多種自身抗原，觸發(fā)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和引起組織纖維化[12]，SLE患者炎癥狀態(tài)擾亂機(jī)體膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)，與脂代謝異常及發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系復(fù)雜。SLE患者的自身致病性抗體也是神經(jīng)精神性紅斑狼瘡(NPSLE)發(fā)病的主要介質(zhì)，NPSLE為影響SLE患者預(yù)后的主要因素之一[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)在ABCG1表達(dá)上調(diào)的CHO-K1細(xì)胞中，在HC組、SY組和SN組中，細(xì)胞的膽固醇外流率均明顯增加，說明ABCG1在膽固醇外流中可能起到促進(jìn)作用，這與在ABCG1低表達(dá)的巨噬細(xì)胞中7-KC和7β-OHC膽固醇外流減少，胞內(nèi)氧化固醇沉積增加[14]的研究結(jié)果在理論上具有一致性；TARLING 等[15]發(fā)現(xiàn) ABCG1 基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域粥樣斑塊體積縮小，巨噬細(xì)胞凋亡增加，提示ABCG1 低表達(dá)造成胞內(nèi)氧化固醇堆積，加速細(xì)胞凋亡，這可能是機(jī)體抗動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制。在多個(gè)動(dòng)物及臨床研究中，ABCG1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用，結(jié)果并不一致，目前仍存在爭(zhēng)議[16]，本研究發(fā)現(xiàn)在ABCG1高表達(dá)的CHO-K1細(xì)胞中，SLE組膽固醇外流率明顯增高，另外與SN組相比，SY組膽固醇外流率明顯增高。

本研究基于去除ApoB血清CEC的研究，主要反映高密度脂蛋白的活性，高密度脂蛋白不僅反映血管中的脂質(zhì)沉積情況，也對(duì)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和免疫功能調(diào)節(jié)起重要作用[17]。SLE患者體內(nèi)存在脂質(zhì)代謝紊亂，血脂水平較健康者明顯增高，研究表明SLE患者存在抗HDLC抗體及HDLC的結(jié)構(gòu)和功能異常，導(dǎo)致SLE血脂譜主要表現(xiàn)為高TG、LDL、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)水平和低HDLC水平，血脂水平的增高可能與SLE患者中膽固醇外流率增加有一定的關(guān)系，但HDLC結(jié)構(gòu)和功能上的變化對(duì)SLE患者膽固醇外流的影響及機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ABCG1在膽固醇外流及動(dòng)脈粥樣硬化中的研究結(jié)果不完全一致，近年有研究證實(shí)PPARγ表達(dá)與激活和膽固醇的外轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，可以促進(jìn)ABCG1的表達(dá)上調(diào)，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[18]。一項(xiàng)PPARγ改善結(jié)核分枝桿菌通過ABCG1依賴性膽固醇外流途徑誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的研究表明PPARγ通過調(diào)節(jié)ABCG1表達(dá)參與改善泡沫狀巨噬細(xì)胞形成[19]。因此，關(guān)于ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流途徑在機(jī)體抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病中特別是在心血管并發(fā)癥高發(fā)的SLE等自身免疫性疾病中的功能及作用機(jī)制都需要進(jìn)一步的深入研究，從而為臨床SLE等自身免疫性疾病中心血管合并癥高發(fā)提供良好的理論基礎(chǔ)和診斷、治療依據(jù)。