mNGS在檢驗與臨床中的應用

李 維，卓 超，許建成，余方友，陳 茶，關(guān)鴻志

1.重慶大學附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心檢驗科，重慶 400012；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸健康研究院感染科，廣東廣州 510120；3.吉林大學第一醫(yī)院檢驗科，吉林長春 130021；4.上海市肺科醫(yī)院/同濟大學附屬肺科醫(yī)院檢驗科，上海 200433；5.廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510006；6.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科，北京 100005

宏基因組二代測序(mNGS)投入臨床使用的時間并不算長，但近些年隨著診斷分子微生物學的飛速發(fā)展，mNGS因具有耗時短、檢測范圍廣等優(yōu)勢受到檢驗科和臨床的廣泛關(guān)注。相較于傳統(tǒng)的臨床微生物的檢測方法，mNGS不僅有效提高了病原微生物的檢出率，也彌補了傳統(tǒng)檢測方法的不足，特別是在某些疑難重癥感染性疾病的精準診療中發(fā)揮著重要作用。隨著近年來mNGS相關(guān)應用規(guī)范及專家共識的相繼出臺[1-5]，如何利用現(xiàn)有的新興檢測手段完善目前的臨床診療路徑，提高對疾病的診斷效率，是檢驗科和臨床都亟待思考的問題。比如mNGS檢測的基本流程和管理要求有哪些?mNGS在鑒別菌種方面的準確性如何?mNGS技術(shù)應用于感染性疾病的臨床適應證有哪些?mNGS報告如何解讀，解讀應注意哪些問題?在什么場景或時機下使用mNGS可以最大化提高患者的預后?醫(yī)院檢驗科可以依托mNGS平臺開展哪些臨床研究工作?檢驗科和臨床對mNGS未來發(fā)展的期待是什么?

關(guān)于mNGS有很多需要深入探討的問題。本期邀請國內(nèi)多位檢驗與臨床的一線專家對mNGS的相關(guān)問題進行了深度探討，同時也對mNGS未來的發(fā)展提出了展望。

1 序列數(shù)的影響因素有哪些?

卓超：mNGS是一種不需要培養(yǎng)，不需要前提假設，從臨床樣品中提取核酸，利用基因組學的方法研究樣品中所有微生物的種類和含量的技術(shù)。mNGS檢測中的Reads指的是匹配到該病原體的序列數(shù)目，其多少與標本中病原體本身載量負荷、核酸提取量、人源序列比例有關(guān)[1]。

2 mNGS技術(shù)應用于感染性疾病的臨床適應證有哪些?微生物學適應證有哪些?耐藥學適應證有哪些?流行病學和感染控制學適應證有哪些?

許建成：當出現(xiàn)以下臨床適應證：(1)不明原因發(fā)熱或發(fā)熱癥候群；(2)急危重癥不除外感染；(3)免疫受損疑似繼發(fā)感染；(4)疑似局部感染，病原學診斷未明確、不及時處理則后果嚴重；(5)高度疑似感染性疾病，常規(guī)抗感染治療無效；(6)慢性感染或慢性疾病不除外感染；(7)食物中毒、溺水、旅游、特殊環(huán)境(不除外感染性疾病)，建議在行常規(guī)手段檢測的同時開展mNGS。但mNGS不適用于評估抗感染治療效果，以及常規(guī)微生物檢查容易明確病原體的感染[2]。

當出現(xiàn)以下微生物學適應證：(1)出現(xiàn)疑似新發(fā)病原體或某特殊病原體；(2)傳統(tǒng)檢測手段無法檢出微生物但確有微生物感染指征；(3)考慮多病原感染，傳統(tǒng)技術(shù)手段只能明確其中一部分，建議常規(guī)手段檢測的同時開展mNGS。感染性疾病已明確病原體或考慮某病原體，需知曉毒力因子相關(guān)信息時，可考慮行mNGS物種鑒定聯(lián)合mNGS檢測毒力基因。

當正常有微生物部位疑似感染，或正常無微生物部位疑似感染但標本有污染時，不建議采用mNGS進行耐藥性檢測；正常無微生物部位疑似感染且標本采集過程污染概率低，考慮采用mNGS進行物種鑒定的同時檢測耐藥基因；有菌種特異性的耐藥性基因的檢測考慮mNGS檢測耐藥基因，預測耐藥表型。

當疑似出現(xiàn)聚集性事件或暴發(fā)事件時，考慮微生物導致感染性疾病，或去過特殊區(qū)域或有特殊工作史，病因未明的感染性疾病，建議常規(guī)手段檢測的同時開展mNGS。

3 mNGS檢測的基本流程和管理要求有哪些?

許建成：標本采集的基本要求：(1)標本應嚴格無菌采集，避免污染；(2)標本應添加核酸穩(wěn)定劑；(3)標本運送過程須防污染、冷鏈快速運送；(4)標本不能及時檢測時，應保存于低于-80℃冰箱或液氮。不同類型標本采集要求見圖1[3]。

注：A為一般類型、無菌標本標本采集要求，B為呼吸系統(tǒng)標本采集要求。

標本長期保存的原則：(1)用于DNA測序的標本在-20℃保存不超過7 d；(2)用于RNA測序的標本應在-80℃保存；(3)避免標本反復凍融，一般不超過3次；(4)理論上-80℃可長期保存；(5)懷疑高致病性或新發(fā)、突發(fā)傳染病，須遵循國際“通用生物安全標本轉(zhuǎn)運要求”包裝及轉(zhuǎn)運要求，盡可能在生物安全條件下提取核酸后再運送標本。

核酸提取的基本要求：(1)建立經(jīng)驗證的標準化核酸提取流程；(2)選擇經(jīng)驗證的病原體核酸提取試劑盒進行提取，應驗證細菌、真菌、病毒、寄生蟲等核酸提取效能，應保證病毒核酸提取完整性，胞壁較厚病原體應采取常規(guī)法以外的破壁方法或以游離核酸(cell free核酸)為檢測對象進行檢測；(3)高宿主背景標本提取時可采用經(jīng)驗證方法去除宿主細胞，如使用去污劑、低滲溶液、抗甲基化DNA磁珠、基因編輯技術(shù)剝離目標序列或在提升檢測靈敏度基礎上選擇cell free核酸進行病原檢測，更大程度降低人源干擾，提升檢測準確性；(4)提取過程應有防污染措施，包括陰性對照和陽性對照。

建庫的基本要求：(1)采用經(jīng)過驗證的流程進行建庫；(2)建庫慎用各種擴增方法，因擴增會使正常菌群或污染病原體序列擴大，導致真正病原體判斷困難。

建庫的主要內(nèi)容包括：(1)制備DNA文庫：包括末端修復、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成等過程；(2)制備RNA文庫：包括去除核糖體、反轉(zhuǎn)錄及雜交、片段化、第一/二鏈合成、末端修復、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成等環(huán)節(jié)；(3)明確核酸質(zhì)量(純度、濃度)及文庫產(chǎn)出標準(文庫濃度、片段大小)；(4)評估外源核酸污染。

測序的基本要求：(1)采用經(jīng)過驗證的流程進行測序；(2)測序原始數(shù)據(jù)應進行質(zhì)控，并且過濾掉低復雜度、低質(zhì)量的序列，確保測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量；(3)標本允許情況下，優(yōu)先進行宏轉(zhuǎn)錄組建庫和測序。在測序過程中，需要注意以下幾點：①不同測序平臺可能會產(chǎn)生不同類型讀長；②測序平臺錯誤率不同，錯誤讀取堿基的概率不同；③測序儀在處理具有大的均聚物重復序列、富含GC、結(jié)構(gòu)重復以及基因組其他復雜區(qū)域標本時，常會錯誤讀取堿基；④不同標本測序深度需求不同，主要由不同標本宿主背景比例、微生物多樣性決定，其次是不同測序平臺和測序成本影響。

生物信息學分析流程應經(jīng)性能確認和驗證，包括數(shù)據(jù)庫優(yōu)化、比對方法和比對參數(shù)的優(yōu)化等，確保準確報告致病病原體。

4 如何考慮mNGS檢出低序列的病毒、分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌?

余方友：對于序列數(shù)的多少才有意義的問題目前沒有統(tǒng)一的規(guī)定。從采集的標本中獲得的結(jié)核分枝桿菌，無論序列數(shù)多少，應慎重對待這些結(jié)果，結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學特征可考慮為病原菌的可能，但也應考慮假陽性的可能。而非結(jié)核分枝桿菌在環(huán)境中大量存在，因此若檢出非結(jié)核分枝桿菌，需要結(jié)合臨床來判斷其致病性。對于分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌等破壁困難的微生物而言，可能提取出的DNA很少，因此即使序列數(shù)很低，也應考慮為致病菌。但對于這類微生物的陰性預測值則需要謹慎考慮，可能因破壁困難，DNA沒有被成功提取，從而導致假陰性的情況。因此需要進一步結(jié)合臨床，并尋找輔助實驗來驗證以確認其致病性。

5 mNGS在鑒別菌種方面的準確性如何，對于定植和感染的區(qū)分是否有明確的依據(jù)。

許建成：mNGS能否準確鑒定定植或感染病原體，目前難有定論。傳統(tǒng)檢測方式，比如痰標本培養(yǎng)，根據(jù)行標或共識容易判斷定植或感染病原體，但是mNGS檢測的病原體種類繁多，許多未知病原體，在數(shù)據(jù)庫或文獻中很難查到相關(guān)信息，此時很難評估定植菌或致病菌，只能不斷積累數(shù)據(jù)，綜合評估。

臨床醫(yī)生是感染性疾病診治的執(zhí)行者，經(jīng)過臨床醫(yī)生的診療實踐，才能確認mNGS報告的病原體是否有價值、患者是否需要治療、治療是否有效等。所以對來自呼吸道、消化道、生殖道等正常有微生物的標本，準確判斷定植或感染病原體還有很長的路要走。工作中時常會遇到病原體檢測報告與患者病情不符的情況，如患者尚未出現(xiàn)明顯感染的臨床表現(xiàn)，但mNGS檢測卻報告出很多病原體，這時需要評估該檢測報告。mNGS檢測范圍很廣，對大部分病原體檢測準確，但臨床醫(yī)生應意識到有些病原體可能是標本采集、核酸提取、建庫引入的污染?？傮w來講，mNGS是一項非常好的技術(shù)，但在區(qū)分定植菌和感染菌方面還有待進一步探討及評估。

6 mNGS報告應如何解讀?

陳茶：第1點，在解讀mNGS報告時應結(jié)合不同的標本類型及檢出病原微生物的種類來分析，同時應關(guān)注該標本是來源于無菌部位還是有菌部位，即在確認致病微生物時應考慮微生物是否真正來源于感染部位，是否是真正的潛在病原菌。第2點，從mNGS報告結(jié)果中時常會發(fā)現(xiàn)常見的、易于培養(yǎng)的病原體，對于這些病原體，建議結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，將兩種方法結(jié)合起來，有助于臨床更加準確地判斷。第3點，需關(guān)注核酸提取過程中破壁較困難的微生物，如分枝桿菌屬、奴卡菌、真菌(尤其是絲狀真菌)等。因為在常規(guī)情況下第三方公司或者實驗室采用的方法對這些破壁困難的微生物的破壁效果可能不好，最后得出的結(jié)果可能是該類微生物序列數(shù)較低，但我們?nèi)孕鑼⑵浼{入可能的病原微生物，并積極采用其他方法進行驗證，如血清學實驗等。雖然mNGS陰性結(jié)果對排除感染有較好的預測價值，但對于核酸提取難度大的微生物，則需要注意其漏檢的情況，即mNGS對此類病原微生物的陰性預測價值較低。第4點，不能通過不同病原微生物檢出序列數(shù)的多少來判斷其致病性的大小，即以序列數(shù)的多少來判斷誰是致病菌誰不是，需結(jié)合微生物種類的差異以及致病性的特點來判斷。最后，mNGS報告的解讀不能僅憑結(jié)果簡單地判斷，還需結(jié)合臨床癥狀，以及臨床微生物、分子生物學、影像學及感染科醫(yī)生等多學科的共同討論，來綜合判斷。

7 宏基因組陰性結(jié)果對排除感染性疾病的價值是什么呢?

陳茶：關(guān)于宏基因組測序陰性結(jié)果對于排除感染的價值問題是目前大家非常關(guān)注的問題。是不是宏基因組測序陰性結(jié)果一定說明不存在感染的情況呢?實際情況并沒有那么簡單。宏基因組測序陰性結(jié)果在大多數(shù)情況下可以排除微生物感染的存在，但謹慎來講，其僅能說明存在感染的可能性較低，因為對于病原微生物數(shù)量少或核酸提取困難的微生物，宏基因組測序可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。想提高宏基因組測序陰性結(jié)果的診斷價值，關(guān)鍵在于應注意整個過程中的環(huán)節(jié)控制，使其避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果的情況。

第1點，關(guān)注標本質(zhì)量問題。正確的檢驗結(jié)果的前提是選擇合適的標本類型及采集合格的標本。注意無菌操作，避免人為的污染。另外，標本保存、運輸條件都非常關(guān)鍵。

第2點，優(yōu)化核酸提取流程。核酸提取過程中的任何環(huán)節(jié)都可能會影響到檢驗結(jié)果，如果臨床已提示可能存在胞內(nèi)菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌等感染，則更應當關(guān)注標本的前期處理等過程。每批樣品都需做陰性或者陽性質(zhì)控，監(jiān)控好每個質(zhì)量環(huán)節(jié)，這有助于提高病原微生物的檢出。在工作中，若遇到宏基因組測序呈陰性結(jié)果，但采用顯微鏡法等傳統(tǒng)檢測方法測出病原體的情況，提示在宏基因組測序的實驗流程，如前期核酸提取等步驟需要優(yōu)化。

第3點，完善數(shù)據(jù)庫。若數(shù)據(jù)庫未及時更新完善，不包括新的或少見物種，也可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此不斷更新和完善數(shù)據(jù)庫的完整性，對于提高病原菌的檢出率非常重要。

綜上，mNGS技術(shù)在微生物檢測方面具有較高的價值，但整個實驗及應用過程，需要進一步去完善，同時，要正確看待其陰性結(jié)果，不能盲目將得到的陰性結(jié)果即認為是排除感染的依據(jù)。

8 mNGS用于感染性疾病的報告解讀應注意哪些問題?

許建成：解讀報告應關(guān)注的參數(shù)包括測序豐度、總序列數(shù)、特異序列數(shù)、閾值、微生物序列的數(shù)據(jù)量、測序深度、測序質(zhì)量、覆蓋度等。

mNGS檢測報告解讀的基本原則之一是分級解讀。其中，高等級條件致病菌(如結(jié)核分枝桿菌等)在大部分標本中均可能是病原體；中等級條件致病菌(如念珠菌屬)在無菌樣本中可能為病原體，但在痰液、肺泡灌洗液等標本中可能是共生菌；低等級條件致病菌(如凝固酶陰性葡萄球菌)在大部分樣本中為共生菌，在少數(shù)情況為致病菌。

檢測報告中的序列數(shù)通常為特異且唯一比對到某病原體基因組上的序列條數(shù)，序列數(shù)越高說明該病原體存在的可信度越高；而同一患者的多個樣本中檢測出相同病原體，此病原體致病的可能性增加。

陰性預測值的報告解讀分以下幾類。第一種情況是在正常菌群樣本(如痰液、肺泡灌洗液等存在微生物的樣本)中，檢測結(jié)果無病原體檢出，但存在較多疑似背景微生物，提示標本為合格標本，應著重關(guān)注患者基本信息及跟進最新臨床病情，綜合判斷，排除感染的可能性。第二種情況是在采集的樣本不能反映感染病灶情況(如肺部感染，但采集標本為外周血)時，檢測結(jié)果和疑似背景微生物均無檢出，對于腦脊液、外周血等無菌樣本可提示排除感染；而痰液、肺泡灌洗液等存在微生物的樣本必須重新回溯檢測流程和質(zhì)控，必要時從樣本核酸提取開始重新檢測和復核。

對罕見病原體、胞內(nèi)菌等特殊病原體的報告解讀困難的原因包括樣本中含量低、胞內(nèi)釋放未完全、核酸提取效率低、序列數(shù)低于報告閾值等。對罕見病原體的報告解讀，應了解比對數(shù)據(jù)庫內(nèi)容，明確是否涵蓋少見病原或新發(fā)病原；結(jié)合病史并進行臨床溝通后再報告。對胞內(nèi)、破壁困難的微生物的報告解讀，可以調(diào)整報告閾值；有時即使序列數(shù)很低，也要考慮為致病體；積極尋找輔助實驗幫助驗證，如特異引物PCR、一代測序、曲霉菌GM試驗、IgG抗體等。

此外，DNA和RNA同時檢出可提示致病的可能性更高。對于重癥疾病、復發(fā)感染、不明原因發(fā)熱、長期使用免疫抑制劑等情況，推薦48～72 h內(nèi)完成檢測并發(fā)出報告。對于常規(guī)易培養(yǎng)的病原微生物，如革蘭陽性菌中的葡萄球菌屬、多數(shù)鏈球菌、腸球菌，革蘭陰性菌中的腸桿菌目等，傳統(tǒng)培養(yǎng)手段能給出較好結(jié)果，并非mNGS優(yōu)勢所在。血漿樣本的游離DNA進行mNGS檢測時，應注意檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是定植菌群所致的一過性菌血癥。

對于不同標本類型的報告解讀，在確認致病微生物時，應考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原體，注意排除常見定植菌、污染菌與工程菌的影響，不同標本類型的報告解讀見圖2[4]。

mNGS檢測結(jié)果應由一定生物信息學知識，從事臨床感染或臨床微生物等專業(yè)人員，結(jié)合患者臨床背景、影像學資料、其他實驗室檢查結(jié)果，綜合判斷。

9 如何逐漸完善目前的臨床診療路徑?新型病原和危重癥患者的診療路徑有何不同?

關(guān)鴻志：臨床診療路徑的選擇需要根據(jù)不同的疾病采取不同的策略。以神經(jīng)感染性疾病為例，新英格蘭雜志一篇實驗室學者發(fā)表的多中心腦脊液第二代測序研究中，從患者發(fā)病到使用腦脊液第二代測序的平均時間為40 d，而我們國內(nèi)神經(jīng)科醫(yī)生做了一項多中心研究，從患者發(fā)病到采用第二代測序的平均時間為10 d。我們當時研究的入組標準為首次腰穿之后無法確診，若經(jīng)驗治療無效，在第二次腰穿時取腦脊液送檢行第二代測序，或是將第一次腰穿凍存的腦脊液送檢行第二代測序，最后統(tǒng)計平均送檢時間為10 d左右，這一入組標準在當時可以作為腦脊液第二代測序的臨床適應證或者推薦檢測時機。而目前臨床上從發(fā)病到進行第二代測序的時間可能已不到一周，或者只有3～4 d。

第二代測序技術(shù)真正改變了神經(jīng)感染性疾病的診斷策略。以往的PCR檢測方法對單純皰疹性腦膜炎的確診率較低，可及性不高。盡管我們推測皰疹性腦炎是國內(nèi)成人最常見的病毒性腦炎類型，但在以前的臨床上卻難以通過檢測證實。腦脊液第二代測序臨床應用，使中國人群的病毒性腦炎病原譜得以逐漸清晰，且隨著第二代測序地廣泛應用，單中心、多中心乃至全國的神經(jīng)感染病原體譜相關(guān)研究也越來越多。

腦脊液第二代測序作為一項單一病原體檢測方法，陽性率可達到30%～40%，這是目前其他技術(shù)檢測無法匹及的。在未來，第二代測序技術(shù)隨著其可及性及成本的降低會被越來越廣泛應用，而成為一種一線檢測方法。目前，對于病因不明的腦炎患者，我們首先選擇可及性更高的一線檢測方法，但如果一線檢測方法無法得出有效的鑒別診斷結(jié)果，則需進行第二代測序，或者對于特殊類型的腦炎，或重癥腦炎，采用傳統(tǒng)檢測技術(shù)可能無法得出可靠結(jié)果時，可采用第二代測序。第二代測序?qū)Φ洼d量病毒靈敏度較高，覆蓋度很廣，因此其正在發(fā)展成為一項一線神經(jīng)性感染疾病的診斷技術(shù)。但我認為它不會替代傳統(tǒng)的診斷技術(shù)，對于黃病毒腦炎等，血清學的檢測，包括IgM抗體檢測仍然主要的確診實驗。第二代測序?qū)NA病毒的檢測，其靈敏度目前還達不到臨床期待的水平。在未來，如果第二代測序成本進一步降低，可及性進一步提高，其可能成為一項一線檢測手段，更多的腦炎病例會在首次腰穿腦脊液檢查時采用第二代測序。有必要探索以第二代測序為核心的神經(jīng)感染病原體診斷策略，第二代測序與傳統(tǒng)檢測手段聯(lián)合應用，傳統(tǒng)檢測方法(如血清學檢測、PCR、培養(yǎng)法等)可作為第二代測序結(jié)果的驗證實驗或補充試驗。

10 在什么場景或時機下使用mNGS可以最大化地提高患者的預后?

關(guān)鴻志：對于疾病而言，精準的診斷是有效治療的基礎。如果以神經(jīng)性感染疾病為例，神經(jīng)性感染疾病患者種類非常多，病情多較危急，現(xiàn)實情況下不允許進行多次經(jīng)驗性治療，我們醫(yī)院目前在進行的腦炎一體化診斷項目，項目入組標準為腦脊液白細胞計數(shù)>5×106L，即根據(jù)國際衛(wèi)生組織標準，存在腦炎的癥狀，且腦脊液白細胞升高可確認為腦炎綜合征。腦炎的病因總體上分為有感染性和自身免疫性兩大類，因此確診腦炎的患者會進行第二代測序和自身免疫性腦炎相關(guān)抗體檢測。如果二者結(jié)果均呈陰性，會追加腫瘤相關(guān)檢測，綜合應用以上技術(shù)可達到60%～70%的確診率，這樣可在首次腰穿后達到一個較高的確診率。若在三、五年前是無法實現(xiàn)這樣高的確診率。我們也希望通過提高確診率，來提高治療的及時性和效果，從而改善患者預后。

11 檢驗科可以依托mNGS平臺開展哪些臨床研究工作?

許建成：第1點，最重要的一點，無論是臨床還是檢驗科都希望做一項工作，就是根據(jù)不同部位或不同類型標本，繪制出致病菌譜。目前在解讀報告時，最常見的問題是需要評估檢測到的病原體是致病菌還是定植菌。因此未來可以設計實驗，分析各種標本的致病菌及定植菌。第2點，感染性疾病不同部位、不同類型標本mNGS檢測的相關(guān)性值得探討。對于同一種感染，我們可以采集不同部位標本，如肺炎患者除了采集痰液，也可以采集血液標本或其他類型標本，因此分析不同部位標本mNGS檢測的價值及相關(guān)性是未來臨床研究工作之一。第3點，雖然目前mNGS檢測主要關(guān)注的是病原體的檢測，對致病菌的耐藥分析還較少關(guān)注，但未來我們可以將mNGS與傳統(tǒng)檢測方法(紙片法、MIC法、PCR法等)比較，探究不同方法之間的相關(guān)性。

12 目前，mNGS檢測臨床應用面臨哪些挑戰(zhàn)?

許建成：mNGS檢測面臨挑戰(zhàn)，包括費用偏高、報告時間偏長、測序深度偏低、目前檢測流程尚未標準化(閾值、背景菌等)、質(zhì)量保證體系尚不完善、報告尚不規(guī)范、報告解讀常與臨床脫節(jié)、與傳統(tǒng)方法的結(jié)合有待加強等。mNGS技術(shù)是一個非常有前景的技術(shù)，但在臨床研究和科研方面，仍需繼續(xù)研究和評估，使其能為臨床提供更有價值的服務。

注：A為無菌標本腦脊液標本類型，B、C為有菌標本呼吸道標本類型。

13 臨床對mNGS未來發(fā)展的期待都是怎樣的，比如需要mNGS有哪些性能上的升級呢?

卓超：目前，在中國，mNGS正處于高速發(fā)展的階段，也幫助臨床解決了很多問題。未來可以優(yōu)化的有以下幾個方面，第1點是DNA/RNA雙流程檢測的問題，在mNGS檢測中，若臨床醫(yī)生默認送檢程序為DNA流程，則可能存在部分重要的RNA病毒(如流感病毒、新型布尼亞病毒等)漏檢的情況。第2點是前處理優(yōu)化問題，mNGS檢測關(guān)鍵的兩個點是核酸富集及去除人源宿主核酸。目前大部分公司采用的是反向富集的方式，采用正向富集的較少，未來可通過正向富集和反向富集結(jié)合的方式來優(yōu)化。此外，可通過定量PCR法檢測人源宿主核酸占比的方式在前處理階段進行優(yōu)化。第3點是數(shù)據(jù)庫優(yōu)化問題，目前很多測序公司直接下載現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，但應用于臨床時會出現(xiàn)錯誤，因此在未來可通過臨床建立數(shù)據(jù)庫，為病原體的檢出和疾病診斷提供更精準的數(shù)據(jù)。第4點是被靶向加靶向的問題，目前mNGS檢測價格昂貴，新開發(fā)的靶向二代測序(tNGS)，可靶向檢測常見的引起感染性疾病的病原體，因此降低了檢測費用，同時還有助于重要的獨立基因和耐藥基因的檢出，從而指導臨床用藥。第5點，也是最難的一點是實現(xiàn)人工智能的解讀，大家公認檢測結(jié)果的解讀需結(jié)合臨床，但是臨床醫(yī)生的認知水平參差不齊，因此，建立人工智能分析，可為基層醫(yī)生或者更多受眾面進行準確地分析提供幫助。第6點是測序公司本土化，本土化對于送檢流程及標本質(zhì)量控制非常重要，目前大部分標本是由臨床醫(yī)生采集后，由第三方公司派人送檢，整個過程均可能造成標本污染，而降低最終報告的可信度和價值。因此在未來，希望mNGS檢測實現(xiàn)本土化，同時與傳統(tǒng)檢測技術(shù)進行比對，最終得到一個準確、可信的報告。

14 檢驗科對mNGS未來發(fā)展的期待都是怎樣的，比如需要mNGS有哪些性能上的升級呢?

李維：第1點是目前收費和檢測成本太高，而國內(nèi)不少醫(yī)院檢驗科都躍躍欲試，希望通過自建平臺或分子實驗室自己做mNGS，首先需要把價格和成本降下來，把實惠留給患者；另外還必須有足夠的標本量才能支撐昂貴的儀器和芯片費用，能否開得起機，這可能是目前醫(yī)院檢驗科想要自建平臺和已經(jīng)開始做mNGS面臨的最大“瓶頸”和最現(xiàn)實的問題。第2點是mNGS報告時間相對較長，離臨床需要的時間有一定的差距。前面專家談到實驗室平臺的本地化，都一致認為本地化檢測是醫(yī)院招標或找第三方平臺的重要衡量標準之一。本地化檢測可明顯縮短報告時間，且可減少因運輸產(chǎn)生的標本交叉污染的問題。第3點是測序深度不夠高的問題，各家平臺和公司的測序深度參差不齊，但沒有相關(guān)法規(guī)做出明確的規(guī)范。當然測序深度的把控需要與檢測成本結(jié)合起來，從中找到既能滿足檢測需求，又能控制檢測成本的平衡點。第4點是標準化問題，2022年國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心公布的mNGS室間質(zhì)評結(jié)果依然不理想，所以各實驗室和第三方平臺的實驗操作還需進一步規(guī)范，比對數(shù)據(jù)庫的選擇需要進一步的標準化，各方面均有待提高。最后一點，檢驗人可在未來將更多的精力投入到耐藥基因的相關(guān)研究上，這可能是下一個值得關(guān)注的“風口”。