小桐子生物堿粗提物殺蟲抑菌活性的初步研究

江文世，李瑤佳，李海生

（西昌學(xué)院 1a.理學(xué)院；1b農(nóng)學(xué)院，四川 西昌 615013；2.樂至縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 資陽 641503）

0 引言

小桐子（Jatropha curcasL.）系大戟科（Euphorbiaceae）麻風(fēng)樹屬（Jatropha）植物，又稱麻風(fēng)樹、羔桐、臭油桐、芙蓉樹，近年來其在西南干熱河谷區(qū)域的種植工作逐步開展［1-3］。它是一種重要的藥用植物，其性寒，具有解毒、止痛、散瘀的作用，臨床用于皮膚瘙癢、跌打損傷及胃腸炎的治療［4-6］，其活性成分較多，尤其是其枝葉和果殼等部位中含有豐富的萜類、黃酮類、多肽等多種物質(zhì)，因具備較強(qiáng)的驅(qū)蚊和驅(qū)蟲、抑菌等功效一直備受關(guān)注［7-9］，但在其生物堿方面的研究相對較少。眾所周知，生物堿是植物次生代謝產(chǎn)物中含量最大的一類［10］，它具有高效、安全、低毒以及對有害生物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，符合人們對理想農(nóng)藥的要求。鑒于生物堿在藥用方面的利用價值，為更好地綜合開發(fā)、利用小桐子資源，對其生物堿在殺蟲、抑菌作用等方面進(jìn)行研究具有十分重要的價值。

為初步探索小桐子生物堿粗提物的殺蟲抑菌活性，采用微量點(diǎn)滴法和生長速率法分別測定小桐子枝葉生物堿粗提物對攀西地區(qū)2種農(nóng)業(yè)主要害蟲（甘藍(lán)蚜蟲、菜青蟲）和3種病原菌（石榴干腐病菌、蘋果腐爛病菌、草莓灰霉病菌）的作用，以期為進(jìn)一步利用小桐子研發(fā)植物源農(nóng)藥提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試蟲：甘藍(lán)蚜和菜青蟲，均為田間收集、飼養(yǎng)。

病原菌：石榴干腐病菌、蘋果腐爛病菌和草莓灰霉病菌，由西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥劑

小桐子生物堿粗提物：參考林巧等［11］的方法，采用超聲法提取小桐子枝葉中的生物堿。其步驟為：（1）按小桐子葉樣品粉末0.5 g和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇按料液比1∶30（g/mL）加入，用1%的鹽酸溶液定容，調(diào)節(jié)pH值；（2）在40 ℃下超聲提取20.15 min后過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，利用二氯乙烷萃取分離，繼而在得到的水相中加入10%碳酸鈉（pH 10）溶液堿化，經(jīng)二氯乙烷萃取分離后將得到的有機(jī)相置于烘箱烘干以獲得生物堿的粗提物。

2.5%溴氰菊酯乳油（EC）：江蘇南京紅太陽集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

50%多菌靈可濕性粉劑（WP）：華陽農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 殺蟲觸殺活性測定

將小桐子生物堿粗提物加一滴吐溫80后再用超純水溶解，先配成1.0×105mg/L母液再用超純水配制試驗(yàn)所需的各質(zhì)量濃度梯度；分別以2.5%溴氰菊酯乳油以及等量超純水加一滴吐溫80的處理為對照，采用微量點(diǎn)滴法進(jìn)行藥劑觸殺活性測定。

1.3.1 蚜蟲觸殺活性測定

選取大小相近的甘藍(lán)蚜成蟲30頭，在前期預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取致死率為10%～90%的5個質(zhì)量濃度，即10、20、50、100、200 mg/L，分別用微量進(jìn)樣器點(diǎn)滴0.1 μL供試藥劑于成蚜的前胸背板處，待藥液自然干后隨即將試蟲轉(zhuǎn)移到新鮮甘藍(lán)葉片上，放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)于25 ℃下培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后觀察記錄試蟲存活和死亡情況，計(jì)算死亡率和校正死亡率，利用各質(zhì)量濃度梯度對數(shù)值和死亡率（或校正死亡率）的概率值為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，通過最小二乘法算出各處理的毒力回歸方程，并對其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，最終求出LC50、LC90。每處理均重復(fù)3次，空白對照組用一滴吐溫80加超純水點(diǎn)滴處理，常規(guī)藥劑對照組以2.5%溴氰菊酯乳油加一滴吐溫80溶液，并用超純水配制的各質(zhì)量濃度梯度藥液點(diǎn)滴處理。

1.3.2 菜青蟲觸殺活性測定

選取個頭長度相近的3齡菜青蟲幼蟲30頭，在前期預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取致死率為15%～90%的5個質(zhì)量濃度，即10、20、50、100、200 mg/L，用微量進(jìn)樣器在幼蟲前胸背板點(diǎn)滴1 μL的供試藥劑，藥液自然干后，將試蟲轉(zhuǎn)移到新鮮葉片在養(yǎng)蟲盒內(nèi)25 ℃培養(yǎng)，分別于24、48、72 h時觀察記錄菜青蟲存活以及死亡情況，后續(xù)處置方法同1.3.1。

1.3.3 試蟲死亡率的計(jì)算

根據(jù)供試害蟲死亡情況，分別按式（1）和式（2）計(jì)算死亡率和校正死亡率。

1.4 對病原真菌的抑制作用測定

采用菌絲生長速率法［12-13］評價小桐子生物堿粗提物對石榴干腐病菌、蘋果腐爛病菌、草莓灰霉病菌的抑制作用。

供試藥液的配制：將小桐子生物堿粗提物加入一滴吐溫80初融后再用超純水溶解，配成1.0×105mg/L母液，分別吸取1 mL母液加入不同比例熱PDA 培養(yǎng)基（55 ℃）倒平板配成5、10、50、100、200、500、1 000 mg/L梯度含藥培養(yǎng)基中；分別以多菌靈和等量超純水加入一滴吐溫80的處理為常規(guī)藥劑對照組和空白對照組，按上述質(zhì)量濃度梯度和方法配制所需培養(yǎng)基，各處理與對照均重復(fù)3次。

在無菌條件下將事先活化好的不同病原菌菌絲塊（直徑4 mm）分別接種于含藥的培養(yǎng)基正中央，每皿接1塊菌餅，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照組的菌落直徑長到距培養(yǎng)皿邊緣1 cm左右時，采用十字交叉法測量所有處理下病原菌的菌落直徑（cm）并做好記錄，計(jì)算抑菌率，通過最小二乘法算出各處理的毒力回歸方程，并對其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，最終求出EC50、EC90，計(jì)算公式如式（3）所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小桐子生物堿粗提物的殺蟲活性

小桐子生物堿粗提物對2種害蟲的觸殺致死作用如表1所示，由于空白對照在飼養(yǎng)中自然死亡率為5%～20%（48 h），數(shù)據(jù)需要校正。由表1可以看出，小桐子生物堿粗提物對甘藍(lán)蚜和菜青蟲有較強(qiáng)的致死作用，其質(zhì)量濃度越高其致死作用越強(qiáng)，在200 mg/L時其對甘藍(lán)蚜和菜青蟲的校正死亡率分別達(dá)到了84.20%和80.04%。

表1 小桐子生物堿粗提物對2種害蟲的觸殺作用（48 h）

以藥劑不同質(zhì)量濃度梯度對數(shù)值（x）為自變量，觸殺活性測定結(jié)果的校正死亡率的概率值（y）為因變量，作直線回歸方程，求出LC50值。比較不同藥劑對2種供試害蟲的殺蟲效果，結(jié)果如表2所示。從表2中的回歸方程可以看出，藥劑不同質(zhì)量濃度梯度對數(shù)值與2種受試害蟲的校正死亡率概率值間均高度線性正相關(guān)。同時，比較LC50值發(fā)現(xiàn)，小桐子生物堿粗提物對甘藍(lán)菜蚜和菜青蟲均具備較強(qiáng)的觸殺毒力，其LC50值范圍為46.249 7～61.064 6 mg/L，LC90值范圍為 331.714 0～342.491 7 mg/L，總體接近2.5%溴氰菊酯 EC的殺蟲效果。此外，在同一處理質(zhì)量濃度下，小桐子生物堿粗提物對甘藍(lán)蚜蟲的LC50和LC90均比菜青蟲的低，表明小桐子生物堿粗提物對甘藍(lán)菜蚜具有更好的觸殺毒力活性。

表2 小桐子生物堿粗提物對2種害蟲的觸殺毒力回歸方程

2.2 小桐子生物堿粗提物的殺菌活性

采用菌絲生長速率法測定小桐子生物堿粗提物對3 種真菌病害的抑菌活性，結(jié)果如表3和4所示。

表3 小桐子生物堿粗提物對3種病原菌的抑制作用

表4 小桐子生物堿粗提物對3種病原菌的毒力回歸方程

由表3和4可知，不同質(zhì)量濃度小桐子生物堿粗提物對供試病原真菌均有一定程度的抑制作用，隨著其質(zhì)量的濃度增加，其抑菌效果呈增加趨勢。同一質(zhì)量濃度間比較，小桐子生物堿粗提物的抑菌活性高于對照藥劑50%多菌靈 WP。綜合室內(nèi)毒力測試結(jié)果，小桐子生物堿粗提物對石榴干腐病菌、蘋果腐爛病菌和草莓灰霉病菌的EC50分別為 70.635 5、 52.400 6和133.412 2 mg/L，對應(yīng)EC90分別為 1 145.794 6、 966.026 7 和 3 601.729 2 mg/L；對照藥劑50%多菌靈WP對上述3種真菌病害的EC50分別為108.755 3、 90.674 0和179.020 9 mg/L， EC90分別為2 502.683 6、 3 268.393 3和6 131.551 1 mg/L，說明小桐子生物堿粗提物中含有一定的抑菌活性成分，其抑菌效果優(yōu)于常規(guī)藥劑多菌靈，其中尤以對蘋果腐爛病菌的抑制作用最強(qiáng)，值得進(jìn)一步研究

3 結(jié)論與討論

小桐子植物資源特別豐富，目前在云南、四川、貴州等地已有大面積栽培［4-5，14］，具備開發(fā)植物源農(nóng)藥的天然條件，其活性成分研究方面時有報道。鄭如剛等［15］利用小桐子種子提取物對小菜蛾、家蠅殺蟲活性測定結(jié)果表明，種子的5種溶劑提取物對2種試蟲的殺蟲活性均較強(qiáng)，其中對小菜蛾的觸殺活性以乙酸乙酯提取物最高，48 h其校正死亡率可達(dá)93.6 %。魏琴等［16］檢測并證實(shí)小桐子種仁中麻瘋樹毒蛋白（curcin）能明顯地抑制水稻稻瘟病、玉米紋枯病等病原真菌絲生長和孢子的萌發(fā)。郭巧生等［17］測定了小桐子枝葉6種不同溶劑提取物對小麥赤霉病菌、稻瘟病菌、煙草疫霉菌和辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制作用，其抑制率分別為87.1%、90.3%、86.4%和77.9%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，從小桐子枝葉中獲得的生物堿粗提物表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。在殺蟲活性方面，小桐子生物堿粗提物不僅對同翅目的甘藍(lán)蚜蟲具有較高觸殺活性，同時對鱗翅目的菜青蟲也具備顯著活性，其LC50值范圍為46.249 7～61.064 6 mg/L，LC90值范圍為 331.714 0～342.491 7 mg/L，總體上與2.5%溴氰菊酯 EC的殺蟲效果相當(dāng)；在抑制病原真菌方面，小桐子生物堿粗提物對石榴干腐病菌、蘋果腐爛病菌和草莓灰霉病菌的EC50分別為70.635 5、 52.400 6和133.412 2 mg/L，其抑菌效果一定程度上優(yōu)于對照藥劑50%多菌靈 WP。

本文僅針對小桐子生物堿粗提物的殺蟲觸殺毒力以及抑制真菌的生物活性方面進(jìn)行了初步探索，其他方面的生物活性以及田間實(shí)際應(yīng)用效果還需進(jìn)一步研究。