綠蘿組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

陸玉建，李雪晗，袁新惠，許悅，朱麗暉，田夢菲，田玉雪，邱欣欣

（1.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603；3.山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

綠蘿為天南星科綠蘿屬常綠觀葉植物，具有較強(qiáng)的吸收甲醛的能力，主要通過扦插的方式進(jìn)行繁殖[1-2]。綠蘿扦插繁殖時生長速度慢，繁殖系數(shù)低，難以進(jìn)行優(yōu)良品種的選育。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)則可彌補(bǔ)上述不足。為此，郭英等[3]以莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.4 mg/L 2，4-D，分化培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA。范俊崗[4]以綠蘿葉片為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果顯示，愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L TDZ+ 0.5 mg/L NAA，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。陳廣玉[5]研究發(fā)現(xiàn)，綠蘿葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D，分化培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA。現(xiàn)階段，綠蘿高效穩(wěn)定的再生體系尚未建立，轉(zhuǎn)基因方面的研究還較少。為提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率，有必要繼續(xù)優(yōu)化綠蘿組織培養(yǎng)條件。

甲醛是一種易揮發(fā)，帶有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體[6]。植物凈化法去除甲醛，不僅具有簡單、經(jīng)濟(jì)、科學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，又有美學(xué)價值與生態(tài)功能，已成為備受青睞的綠色修復(fù)技術(shù)[7]。高等植物去除甲醛與甲醛脫氫酶（FALDH）密切相關(guān)，在FALDH的參與下，甲醛方可進(jìn)入植物組織并最終轉(zhuǎn)化為CO2[8]。目前已經(jīng)擬南芥、玉米、綠蘿等多種植物中分離獲得了FALDH[9-11]。擬南芥中AtFALDH過表達(dá)，擬南芥甲醛吸收能力明顯增強(qiáng)[12]。將綠蘿FALDH基因轉(zhuǎn)入擬南芥，擬南芥甲醛吸收效率同樣提高[11,13]。雖然綠蘿吸收甲醛的能力較強(qiáng)，但仍有待于進(jìn)一步提高，而通過基因工程技術(shù)提高綠蘿吸收甲醛的能力無疑是一種非常有效的途徑。目前，有關(guān)FALDH基因轉(zhuǎn)化綠蘿的研究尚未見相關(guān)報道，本試驗(yàn)在建立綠蘿高頻再生體系的基礎(chǔ)上，將AtFALDH導(dǎo)入綠蘿中，試圖實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)綠蘿吸收甲醛的能力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為小葉綠蘿（Eipremnum aureum），大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌GV3101。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠蘿離體再生 以綠蘿葉片和葉柄為外植體，分別用70%酒精消毒30 s，用0.1%升汞處理15 min，無菌水沖洗5～6次。將外植體接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1，共9個處理），30 d后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率。將葉片或葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種入分化培養(yǎng)基（表2，共9個處理），30 d后觀察不定芽的分化情況，統(tǒng)計愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率。將不定芽插入生根培養(yǎng)基中（表3，共6個處理），30 d后統(tǒng)計不定芽的生根率。

1.2.2 目的基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建 擬南芥甲醛脫氫酶基因AtFALDH引物序列（下劃線代表酶切位點(diǎn)的位置）如下，AtFALDHLP：5'-GGGGAG CTCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATCA-3'（SacⅠ），AtFALDHRP：5'-GGGTCTAGATTT GCTGGTATCGAGGACACAACG-3'（XbaⅠ）。提取擬南芥RNA，高保真PCR擴(kuò)增AtFALDH基因。

將PCR擴(kuò)增的AtFALDH基因插入pMD18-T載 體，用SacⅠ-XbaⅠ分 別 酶 切pMD18-TAtFALDH和p2300-gfp，將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，從而構(gòu)建p2300-AtFALDH-gfp表達(dá)載體。

1.2.3 綠蘿遺傳轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)含p2300-AtFALDHgfp表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，使其OD600值分別為0.2、0.5和1.0，離心后用MS培養(yǎng)基重懸浮，將綠蘿葉柄愈傷組織置于菌液中侵染5、10 min或15 min，共培養(yǎng)1、2 d或3 d；然后轉(zhuǎn)入含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，誘導(dǎo)抗性芽。根據(jù)綠蘿愈傷組織的分化率確定適宜的轉(zhuǎn)化條件。切取抗性不定芽，誘導(dǎo)生根，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因綠蘿。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過SPSS 17.0軟件中單因素方差分析對數(shù)據(jù)之間的差異性進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠蘿再生體系優(yōu)化

2.1.1 植物生長物質(zhì)對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 統(tǒng)計分析結(jié)果表明（表1），綠蘿葉片在AC3、AC4、AC6、AC8和AC9培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，其愈傷組織誘導(dǎo)率介于9.1%～61.5%。其中，AC9的效果最好，葉片產(chǎn)生愈傷組織的量也較多，與其他培養(yǎng)基相比，愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著。葉柄在9種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生愈傷組織，其中效果最好的為AC4，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到97.8%，不僅產(chǎn)生愈傷組織的量較多，而且生長比較旺盛；其次是AC3和AC9，愈傷組織的誘導(dǎo)率也在90%以上，這3種培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率和其他大部分培養(yǎng)基相比，存在較顯著的差異；再次為AC6，其愈傷組織的誘導(dǎo)率接近90%；其他幾種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果則稍差。

表1 綠蘿葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率變化Tab.1 Callus induction rate change of leaves and petioles of Eipremnum aureum

2.1.2 植物生長物質(zhì)對綠蘿不定芽誘導(dǎo)的影響 統(tǒng)計分析結(jié)果表明（表2），葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織只有在A4、A8、A9中方可誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的不定芽，其中，A8中不定芽生長良好，分化率可以接近100%，和其他8種培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率之間存在顯著的差異；其次為A4和A9，分化率約為67%，其余培養(yǎng)基中無明顯不定芽產(chǎn)生。葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織在這9種培養(yǎng)基中都有不定芽的分化，其 中，A2、A3、A4、A6、A8、A9的 分 化 率 均 接 近100%，和其他3種培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率之間存在顯著的差異。其次為A5、A7，其芽的分化率也在50%～70%，芽分化明顯，但分化率較低。較差的為A1，芽分化率30%左右。總體來說，A9的效果最佳，不僅不定芽分化率較高，而且不定芽數(shù)量較多，生長旺盛；葉柄愈傷組織誘導(dǎo)不定芽效果明顯要優(yōu)于葉片。

表2 綠蘿葉片和葉柄愈傷組織分化率變化Tab.2 Callus differentiation rate change of leaves and petioles of Eipremnum aureum

2.1.3 植物生長物質(zhì)對綠蘿不定芽生根的影響 將葉片或葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽切下，進(jìn)行生根培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計不定芽的生根情況。結(jié)果表明，在6種培養(yǎng)基中均有根的生成，而且根的長勢較好，生根率都為100%，其中R2生根效果最好，根粗壯，長度合適，須根數(shù)量適宜，利于移栽成活（表3）。

表3 綠蘿不定芽生根率變化Tab.3 Rooting rate change of adventitious buds of Eipremnum aureum

2.2 綠蘿的離體再生

將綠蘿葉片接種到培養(yǎng)基AC9中，30 d后可誘導(dǎo)產(chǎn)生少量乳白色的愈傷組織（圖1-A）。繼代培養(yǎng)14 d后，愈傷組織的量明顯增加（圖1-B）。將愈傷組織轉(zhuǎn)入A8中進(jìn)行分化培養(yǎng)，7 d左右即可有不定芽產(chǎn)生（圖1-C），30 d后可誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的不定芽，繼代培養(yǎng)后生長較壯（圖1-D）。將葉柄接種到培養(yǎng)基AC4中，30 d后可誘導(dǎo)出較多的愈傷組織，繼代培養(yǎng)14 d后愈傷組織的量明顯增加（圖1-E）。將愈傷組織轉(zhuǎn)入A9 中7 d后，愈傷組織開始分化；經(jīng)14 d左右的分化培養(yǎng)，愈傷組織開始產(chǎn)生肉眼可見的不定芽（圖1-F）。增殖培養(yǎng)后，不定芽的數(shù)量明顯增多（圖1-G）。將不定芽轉(zhuǎn)入R2中誘導(dǎo)生根，經(jīng)30 d培養(yǎng)可以獲得試管苗（圖1-H）。

圖1 綠蘿離體再生的過程Fig.1 The regeneration of Eipremnum aureum in vitro

2.3 p2300-AtFALDH-gfp表達(dá)載體的構(gòu)建

為了轉(zhuǎn)化綠蘿，首先要進(jìn)行表達(dá)載體p2300-AtFALDH-gfp的構(gòu)建（圖2-A）。提取擬南芥RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR擴(kuò)增AtFALDH基因（圖2-B）。將回收的AtFALDH基因連入pMD18-T載體。通過PCR和酶切對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，顯示AtFALDH已插入pMD18-T（圖2-C、D）。分別酶切p2300-gfp和pMD18-T-AtFALDH，回收連接目的片段。PCR和酶切鑒定結(jié)果表明，AtFALDH基因已插入p2300-gfp，從而實(shí)現(xiàn)p2300-AtFALDHgfp載體的構(gòu)建（圖2-E、F）。

圖2 p2300-AtFALDH-gfp表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of p2300-AtFALDH-gfp expression vector

2.4 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

不同處理?xiàng)l件下綠蘿的轉(zhuǎn)化率如表4所示。

表4 不同處理?xiàng)l件下綠蘿的轉(zhuǎn)化率變化Tab.4 Transformation rate change of Eipremnum aureum under different treatment conditions

為了提高綠蘿的轉(zhuǎn)化效率，需對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明（表4），當(dāng)農(nóng)桿菌的OD600值為0.5時，葉柄愈傷組織的分化率較高，抗性芽較多，但和OD600值為1.0時區(qū)別并不顯著。侵染時間為5 min時，轉(zhuǎn)化率較低；侵染時間為10 min時，轉(zhuǎn)化率明顯提高；侵染時間為15 min時，轉(zhuǎn)化率有所降低，外植體污染率提高。綠蘿愈傷組織和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2 d時，愈傷組織分化率較高，轉(zhuǎn)化效果較好，和共培養(yǎng)1 d時存在顯著的差異。

3 結(jié)論與討論

甲醛是室內(nèi)裝修的主要環(huán)境污染物，具有強(qiáng)烈的致癌和促癌作用[14]。微生物應(yīng)對甲醛毒性可歸納為2種機(jī)制：利用同化途徑固定甲醛以及通過異化途徑氧化甲醛最終生成CO2[15]。甲基營養(yǎng)細(xì)菌通過3種甲醛同化途徑去除甲醛，分別為核酮糖單磷酸途徑、絲氨酸途徑和核酮糖二磷酸途徑[16-17]。而在甲基營養(yǎng)酵母中，甲醛可與谷胱甘肽結(jié)合產(chǎn)生S-羥甲基谷胱甘肽，然后經(jīng)依賴谷胱甘肽的氧化途徑形成CO2[6]。該途徑需FALDH、S-甲酰谷胱甘肽水解酶（FGH）和甲酸脫氫酶（FDH）共同參與完成[18]。高等植物去除甲醛高度依賴FALDH，在甲醛進(jìn)入植物組織以及轉(zhuǎn)化為CO2的過程中FALDH都具有重要作用[8]。一些觀葉植物具有高效凈化甲醛污染的效果，因此，通過綠色植物清除甲醛成為人們首選的生態(tài)治理手段[7,19]。即便如此，綠色植物吸收甲醛的能力依然有限。因此，如何更有效的增強(qiáng)植物去除甲醛的能力受到了越來越多的關(guān)注。而通過基因工程技術(shù)將FALDH基因?qū)胫参铮翘岣呤荏w植物去除甲醛能力的重要途徑之一。高頻離體再生體系的建立是植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，本研究以綠蘿葉片和葉柄為外植體，優(yōu)化綠蘿離體再生條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，葉片、葉柄都均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但葉柄形成愈傷組織的效果更佳，其中培養(yǎng)基添加0.5 mg/L TDZ和0.5 mg/L NAA有利于葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)，這和郭英等[3]、范俊崗[4]、陳廣玉[5]的研究結(jié)果存在一定的差異，很可能是由于外植體不同造成的。影響愈傷組織分化最主要的植物生長物質(zhì)是6-BA和NAA。當(dāng)二者比例合適時，愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)量較多，生長旺盛；反之，愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽數(shù)量較少，生長遲緩。綠蘿葉片和葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織均可分化為不定芽，但不定芽的分化效果葉柄愈傷組織明顯優(yōu)于葉片。因此，不定芽的誘導(dǎo)率不僅與植物生長物質(zhì)的比例有關(guān)，同時也與愈傷組織的來源有一定的關(guān)系。綠蘿葉柄愈傷組織分化最適培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。綠蘿比較容易生根，當(dāng)培養(yǎng)基為1/2 MS，生根效果較好。添加一定濃度的NAA，可有效促進(jìn)生根。由于綠蘿葉柄離體再生的頻率比較高，因此，本研究采用葉柄愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間等條件均會影響到受體的轉(zhuǎn)化效率[20-21]。本研究的結(jié)果表明，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600值為0.5時，易和受體細(xì)胞接觸，侵染能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率較高。農(nóng)桿菌侵染葉柄愈傷組織10 min效果較好，侵染5 min時抗性芽分化率過低；侵染時間15 min時，葉柄愈傷組織容易褐化，污染比較嚴(yán)重。葉柄和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2 d時效果較好，轉(zhuǎn)化效率高而污染率低。

本研究的結(jié)果表明，綠蘿葉片在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率為61.5%，葉柄在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到97.8%，并且產(chǎn)生愈傷組織的量較多。將葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織在MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中芽分化較明顯，而葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織在MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中芽分化效果最佳，且葉柄愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的效果要優(yōu)于葉片。不定芽生根最適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.05 mg/L NAA。用含p2300-AtFALDH質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化綠蘿，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600值為0.5，侵染10 min，共培養(yǎng)2 d時，綠蘿愈傷組織分化抗性芽的效率較高，轉(zhuǎn)化效果較好。在最適轉(zhuǎn)化條件下，將AtFALDH基因?qū)刖G蘿細(xì)胞中，經(jīng)抗生素篩選，初步獲得了具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，但其吸甲醛功效還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。