miR-299-5p靶向KLF3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

王艷明 羅 波 黃 磊 （武漢市武昌醫(yī)院，武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院感染性疾病科，武漢 430063）

肝癌是受多種因素影響的發(fā)病于肝臟的惡性腫瘤，是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)癌癥性相關(guān)疾病死亡的第二主要原因，通常分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，其中原發(fā)性肝癌比較常見，主要有肝區(qū)疼痛、乏力、消瘦、進(jìn)行性肝腫大等不良癥狀，發(fā)展到后期會(huì)導(dǎo)致肝腎衰竭、肝癌破裂出血等，對(duì)患者的生命安全造成威脅［1-2］。早期診斷方法不足、生存率較低等原因?qū)е挛覈伟┌l(fā)病率較高，因此探究能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖及遷移的靶向分子對(duì)肝癌的臨床治療具有重要意義［3］。miRNA 是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，與癌癥等許多疾病密切相關(guān)，并參與細(xì)胞增殖、遷移等多種生物學(xué)進(jìn)程［4-5］。多項(xiàng)研究顯示miR-299-5p 在結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中低表達(dá)，miR-299-5p表達(dá)上調(diào)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［6-7］。梅博升等［8］研究發(fā)現(xiàn)，虎眼萬年青皂苷類提取物能通過上調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-299-5p 等多種miRNAs 的表達(dá)作用于肝癌細(xì)胞的增殖分化及凋亡過程，但關(guān)于miR-299-5p 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移作用的影響及相關(guān)機(jī)制研究較少。資料顯示人類Krüppel 樣因子3（human Krüppel like factor 3，KLF3）含有同源鋅指結(jié)構(gòu)，能與DNA 中含有GC 的區(qū)域結(jié)合，在肺癌中表達(dá)增高，KLF3 基因敲除可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但關(guān)于KLF3 在肝癌細(xì)胞中的作用并不明確［9］。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-299-5p 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控及其與KLF3 的關(guān)系，為肝癌的診斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 HL-7702 人正常肝細(xì)胞株及Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 人肝癌細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000 Reagent（貨號(hào)：11668-027）購于美國Invitrogen；RIPA 裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（貨號(hào)：P0013C、P0027、P0009）購于上海碧云天公司；細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（貨號(hào)：BB-4101）購于貝博生物；RNA 提取試劑盒、CCK-8 試劑盒、青鏈霉素混合液、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液（貨號(hào)：R2220、CA1210、P1400、11011-8611、31600）購于北京索萊寶科技有限公司；KLF3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、GAPDH 抗體、羊抗兔IgG（貨號(hào)：ab154531、ab13847、ab32503、ab321124、ab92536、ab76003、ab8245、ab150077）購于英國Abcam。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：MCO-15AC）購于日本SANYO；倒置顯微鏡（型號(hào)：TS100）購于日本Nikon；細(xì)胞計(jì)數(shù)器（型號(hào)：NC-100）購于丹麥Chemimetec；PCR 儀（型號(hào)：simpliamp）購于美國ABI；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Accuri C6）購于美國BD；酶標(biāo)儀（型號(hào)：XElx800）購于美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HL-7702、Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 細(xì)胞株置于37 ℃水浴鍋中快速融化，轉(zhuǎn)移至特定離心管，懸浮接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過程均用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組及pcRNA 轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長期的HepG2 肝癌細(xì)胞，以4×106個(gè)/ml接種于6 孔板，每孔2 ml，待細(xì)胞貼壁后分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-299-5p 組、miR-299-5p+pc-KLF3 組，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性mimic，miR-299-5p 組轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic，miR-299-5p+pc-KLF3 組共轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic 及pc-KLF3，轉(zhuǎn)染結(jié)束后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h，PBS 洗滌2次后加入含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，收集各組HepG2 肝癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 檢測肝癌細(xì)胞中miR-299-5p 表達(dá) 參照RNA 提取試劑盒說明書提取肝癌細(xì)胞、正常肝細(xì)胞、1.2.2中各組細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-299-5p 正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGTTTACCGTCCCAC-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATGTATGT-3'；內(nèi)參U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。總反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，H2O 8 μl，正反向引物各0.5 μl，10× cDNA 模板1 μl。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸50 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。根據(jù)2?ΔΔCt算法分析各肝癌細(xì)胞、正常肝細(xì)胞、1.2.2 中各組細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 采用TargetScan 數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_71/）分析預(yù)測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用位點(diǎn)，構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）基因靶點(diǎn)KLF3 的3'-UTR 熒光素酶表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染至陰性對(duì)照組和miR-299-5p 組HepG2 肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 測定熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 CCK-8 法檢測HepG2 肝癌細(xì)胞增殖情況 取各組HepG2 細(xì)胞，以5×106個(gè)/孔接種于96 孔板，分別在轉(zhuǎn)染0 h、12 h、24 h、48 h 后，每孔加入CCK-8試劑10μl 和9 μl 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。于全自動(dòng)酶標(biāo)儀中檢測每孔細(xì)胞的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2 肝癌細(xì)胞凋亡情況 參考文獻(xiàn)［10］采用Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒測定細(xì)胞凋亡，各組HepG2細(xì)胞采用胰蛋白酶消化，消化結(jié)束后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，轉(zhuǎn)移至無菌1.5 ml EP 管，經(jīng)PBS 清洗、70%乙醇溶液4 ℃固定過夜、PBS 溶液清洗后離心并重懸細(xì)胞，依次加入2μl RNA酶、1μl Triton X-100，靜置45 min后加入2 μl PI 溶液染色1 h，于流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測HepG2 肝癌細(xì)胞侵襲能力 收集各組HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/ml，取200 μl 細(xì)胞液加入預(yù)鋪設(shè)好的Transwell 小室上室，以RPMI1640 培養(yǎng)液補(bǔ)至1 ml，下室加入600μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后擦拭未過膜的細(xì)胞，置于4%多聚甲醛中固定20 min，室溫條件下風(fēng)干，采用1%結(jié)晶紫染液浸染20 min，室溫條件下風(fēng)干，于光學(xué)顯微鏡下觀察小室細(xì)胞侵襲情況。隨機(jī)取6 個(gè)視野，計(jì)算穿過Matrigel 基質(zhì)的平均細(xì)胞數(shù)［11］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HepG2肝癌細(xì)胞遷移能力 收集各組HepG2 細(xì)胞，將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿板內(nèi)85%左右時(shí)，以200 μl 槍頭垂直于6 孔板底部做直線劃痕，然后將細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)24 h 后，倒置光學(xué)顯微鏡下拍照（×100）觀察，利用Image J 軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾?，并?jì)算細(xì)胞劃痕愈合率［12］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 Western blot 檢測 采用Western blot 檢測1.2.2 中各組細(xì)胞KLF3、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子相關(guān)蛋白的表達(dá)，RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞中總蛋白含量，采用SDSPAGE 分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5% 脫脂牛奶封閉，于4 ℃下添加KLF3、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 兔抗鼠一抗與GAPDH（1∶500）孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌后添加二抗（辣根過氧化物酶綴合的二抗，1∶5 000）常溫下孵育2 h。采用蛋白成像凝膠儀對(duì)KLF3、凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3、Bax、Bcl-2）、遷移相關(guān)蛋白（MMP-2、MMP-9）水平進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌細(xì)胞株中miR-299-5p表達(dá)水平比較 與HL-7702 細(xì)胞相比，Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 細(xì)胞中miR-299-5p 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），其中HepG2 細(xì)胞株中miR-299-5p 表達(dá)水平最低，選取HepG2 細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 人肝癌細(xì)胞株中miR-299-5p表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of miR-299-5p expression level in human hepatoma cell lines（±s，n=3）

表1 人肝癌細(xì)胞株中miR-299-5p表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of miR-299-5p expression level in human hepatoma cell lines（±s，n=3）

Note：Compared with HL-7702 cell line，1）P<0.05.

miR-299-5p/U6 1.01±0.15 0.50±0.071）0.61±0.091）0.21±0.031）0.49±0.071）0.45±0.061）Cell line HL-7702 Hep3B HuH-7 HepG2 SMMC-7721 MHCC97-L

2.2 各組HepG2 細(xì)胞中miR-299-5p 及KLF3 蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細(xì)胞中miR-299-5p表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），KLF3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細(xì)胞中KLF3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見圖1、表2。

表2 各組HepG2細(xì)胞中miR-299-5p及KLF3蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of miR-299-5p and KLF3 protein expression levels in HepG2 cells of each group（±s，n=3）

表2 各組HepG2細(xì)胞中miR-299-5p及KLF3蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of miR-299-5p and KLF3 protein expression levels in HepG2 cells of each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with miR-299-5p group，2）P<0.05.

KLF3/GAPDH 1.15±0.17 1.18±0.19 0.33±0.031）0.66±0.051）2）34.002 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 F P miR-299-5p/U6 0.94±0.13 0.97±0.14 1.89±0.301）1.74±0.281）14.667 0.001

圖1 各組HepG2細(xì)胞中KLF3蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of KLF3 protein in HepG2 cells of each group

2.3 miR-299-5p與KLF3的靶向關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證 TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miR-299-5p 在KLF3 3'-UTR區(qū)有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)（圖2）；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與KLF3 WT+陰性對(duì)照組相比，KLF3 WT+miR-299-5p 組HepG2 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），KLF3 MUT+陰性對(duì)照組與KLF3 MUT+miR-299-5p 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用關(guān)系（±s，n=3）Tab.3 Relationship between miR-299-5p and KLF3 by luciferase reporter assay（±s，n=3）

表3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用關(guān)系（±s，n=3）Tab.3 Relationship between miR-299-5p and KLF3 by luciferase reporter assay（±s，n=3）

Note：Compared with KLF3 WT+negative control group，1）P<0.05.

Relative luciferase activity 1.02±0.16 0.57±0.081）1.03±0.16 1.01±0.15 67.939 0.000 Groups KLF3 WT+negative control KLF3 WT+miR-299-5p KLF3 MUT+negative control KLF3 MUT+miR-299-5p F P

圖2 miR-299-5p與KLF3的3'-UTR區(qū)序列相互結(jié)合Fig.2 Interaction between miR-299-5p and 3'-UTR region of KLF3

2.4 各組HepG2 細(xì)胞增殖情況比較 與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p 組HepG2 細(xì)胞增殖能力在24 h和48 h時(shí)顯著下降（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細(xì)胞增殖能力在48 h時(shí)顯著提高（P<0.05）。見表4、圖3。

圖3 各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較Fig.3 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group

表4 各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表4 各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with miR-299-5p group，2）P<0.05.

48 h OD 1.01±0.13 0.96±0.11 0.65±0.071）0.83±0.082）7.690 0.010 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 F P 0 h OD 0.35±0.02 0.36±0.01 0.33±0.03 0.38±0.02 2.889 0.102 12 h OD 0.53±0.04 0.51±0.05 0.49±0.04 0.53±0.03 0.667 0.596 24 h OD 0.80±0.09 0.78±0.08 0.60±0.061）0.77±0.07 4.465 0.040

2.5 各組HepG2 細(xì)胞凋亡情況比較 與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax 蛋白顯著降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見圖4、5、表5。

表5 各組HepG2細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表5 各組HepG2細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with negative control group，2）P<0.05；compared with miR-299-5p group，3）P<0.05.

Bcl-2/GAPDH 1.03±0.12 1.02±0.11 0.31±0.041）2）0.74±0.081）2）3）39.710 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 Apoptosis rate（%）11.08±1.17 10.97±1.15 28.42±4.371）2）15.91±2.561）2）3）28.559 0.000 Caspase-3/GAPDH 0.93±0.11 0.97±0.11 1.87±0.211）2）1.32±0.161）2）3）24.199 0.000 Bax/GAPDH 1.01±0.12 0.98±0.11 1.90±0.231）2）1.41±0.181）2）3）19.896 0.000 F P

圖4 各組HepG2細(xì)胞凋亡情況比較Fig.4 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group

圖5 各組HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況比較Fig.5 Comparison of protein expressions of apoptosis related factors in HepG2 cells of each group

2.6 各組HepG2 細(xì)胞侵襲及遷移情況比較 與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3組肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著提高（P<0.05）。見表6、圖6~8。

表6 各組HepG2細(xì)胞侵襲及遷移情況比較（±s，n=3）Tab.6 Comparison of invasion and migration of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表6 各組HepG2細(xì)胞侵襲及遷移情況比較（±s，n=3）Tab.6 Comparison of invasion and migration of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with negative control group，2）P<0.05；compared with miR-299-5p group，3）P<0.05.

MMP-9/GAPDH 0.97±0.12 1.01±0.14 0.31±0.041）2）0.72±0.081）2）3）29.569 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 Number of invasive cells（n）142.60±25.02 143.00±25.13 66.58±10.111）2）93.42±12.601）2）3）11.338 0.003 Wound healing rate（%）25.66±2.37 26.12±2.43 9.08±1.161）2）20.11±1.841）2）3）46.395 0.000 F P MMP-2/GAPDH 1.02±0.12 0.98±0.11 0.26±0.061）2）0.73±0.081）2）3）40.140 0.000

圖6 各組HepG2細(xì)胞侵襲情況比較Fig.6 Comparison of invasion of HepG2 cells in each group

圖7 各組HepG2肝癌細(xì)胞遷移情況比較Fig.7 Comparison of migration of HepG2 cells in each group

圖8 各組HepG2細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.8 Expressions of migration related proteins of HepG2 cells in each group

3 討論

miRNA 是進(jìn)化保守性的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于生物體細(xì)胞及組織中，通過調(diào)控基因表達(dá)參與肝癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生、分化及轉(zhuǎn)移，肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究表明miRNA 表達(dá)異?？捎绊懜伟┘?xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程［13］。miR-299-5p是miRNA家族成員，研究表明miR-299-5p在胃癌患者組織中低表達(dá)，可作為腫瘤標(biāo)志物診斷胃癌的發(fā)生［14］；miR-299-5p 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中也呈低表達(dá)［15］。本研究結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞株相比，肝癌細(xì)胞中miR-299-5p 表達(dá)水平顯著降低，提示miR-299-5p 可能在某種程度上參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展。因涉及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，故選取miR-299-5p表達(dá)水平較低的HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

KLF 家族是真核生物的一類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，目前在人類基因組中識(shí)別出18 種KLFs，分別為KLF1~18［16］。KLF 家族具有調(diào)節(jié)富含CACCC 和GC啟動(dòng)子基因表達(dá)作用，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、脂肪形成、腫瘤生成、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用［17］。研究表明miR-1224 在肺癌組織中低表達(dá)，miR-1224表達(dá)上調(diào)后可通過與KLF3 的3'-UTR 區(qū)結(jié)合下調(diào)KLF3表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡［18］。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 肝癌細(xì)胞中miR-299-5p 表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，KLF3蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，表明miR-299-5p 具有下調(diào)KLF3 表達(dá)的作用，可能與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為存在一定聯(lián)系。miRNA 常結(jié)合到靶基因的3'-UTR區(qū)，從而調(diào)控靶基因功能，通過查閱TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測KLF3 是miR-299-5p 的潛在靶基因，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證miR-299-5p 過表達(dá)能顯著下調(diào)野生型KLF3-3'UTR 熒光素酶活性，表明在肝癌細(xì)胞中miR-299-5p 可直接作用于KLF3 的3'-UTR區(qū)，進(jìn)而調(diào)控KLF3的基因表達(dá)。

正常的細(xì)胞增殖、凋亡存在動(dòng)態(tài)平衡，癌細(xì)胞的增殖、凋亡抵抗、侵襲、遷移等均是腫瘤細(xì)胞重要的惡性生物學(xué)行為，受細(xì)胞周期等多種機(jī)制調(diào)控［19］。李楠等［20］和郭令飛等［21］研究發(fā)現(xiàn)miR-299-5p 過表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖活力，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-299-5p 可顯著抑制HepG2 細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)其凋亡，并顯著降低其侵襲及遷移能力。細(xì)胞凋亡相關(guān)因子（Caspase-3、Bax、Bcl-2）在腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中表達(dá)水平不同，測定這些因子的表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡情況［22］。細(xì)胞遷移相關(guān)因子（MMP-2、MMP-9）與癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［23］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-299-5p可顯著提高Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平，降低Bcl-2、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平，QIAN 等［24］研究顯示，miR-1204 可通過抑制DEK 表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，并顯著降低Bcl-2 表達(dá)，提高Bax 表達(dá)，PENG 等［25］研究發(fā)現(xiàn)miR-1301-3p 通過靶向ICT1 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，與本研究結(jié)果類似，表明miR-299-5p可能通過其他信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及遷移活性，因此仍需深入研究。

綜上所述，過表達(dá)miR-299-5p 可降低HepG2 肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，促進(jìn)HepG2 細(xì)胞凋亡，可能與miR-299-5p 作用于KLF3 有關(guān)，但肝癌細(xì)胞增殖機(jī)制復(fù)雜，仍需深入研究。