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      lncRNA DLGAP1-AS2靶向miR-1193調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究①

      2023-01-16 12:08:28曹淑琴朱朝勇陳維英祁永花張曉媛徐建國(guó)青海紅十字醫(yī)院腫瘤二病區(qū)西寧810000
      中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年19期
      關(guān)鍵詞:熒光素酶克隆靶向

      曹淑琴 朱朝勇 陳維英 祁永花 張曉媛 徐建國(guó) (青海紅十字醫(yī)院腫瘤二病區(qū),西寧 810000)

      肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總發(fā)病率的85%,分子生物學(xué)技術(shù)和分子靶向治療的發(fā)展及實(shí)體腫瘤靶向治療水平的不斷提高給NSCLC患者帶來(lái)了希望[1-2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表達(dá)失調(diào)與NSCLC進(jìn)展有關(guān),且在多種癌癥類型中發(fā)揮抑癌或癌基因作用[3]。DLGAP1反義RNA 2(DLGAP1 antisense RNA 2,DLGAP1-AS2)是一種胞質(zhì)lncRNA,研究報(bào)道lncRNA DLGAP1-AS2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中上調(diào),且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān);敲低DLGAP1-AS2 不僅在體外抑制細(xì)胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也在體內(nèi)抑制異種移植神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[4]。抑制DLGAP1-AS2可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-154-5p甲基化抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[5]。然而DLGAP1-AS2在NSCLC 中的作用及機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)DLGAP1-AS2 的靶基因,發(fā)現(xiàn)DLGAP1-AS2 與miR-1193 存在結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-1193 通過(guò)直接靶向跨膜9 超家族3(TM9SF3)抑制人T 細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。LINC00963 通過(guò)調(diào)控通過(guò)miR-1193/SOX4 軸抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展[7]。miR-1193 對(duì)NSCLC 的影響也不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA DLGAP1-AS2 和miR-1193 對(duì)NSCLC 的影響及DLGAP1-AS2是否調(diào)控miR-1193。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 組織樣本 選取青海紅十字醫(yī)院收治的49 例肺癌患者的癌組織及癌旁組織,距離癌組織邊緣2~5 cm 處切除的組織為癌旁組織,所有患者經(jīng)病理診斷確診,有完整的臨床病理資料,均知情同意。49例患者包含男30例,女19例,年齡39~76歲。鱗癌14例、腺癌23 例、大細(xì)胞癌2 例、混合細(xì)胞癌10 例。根據(jù)TNM 分期,Ⅰ期5 例、Ⅱ期9 例、Ⅲ期17 例、Ⅳ期18例。

      1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 NSCLC 細(xì)胞株A549 購(gòu)自美國(guó)ATCC;RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;SYBR Premix ExTaqTM試劑盒自日本TaKaRa 公司;MTT 試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所;全蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞處理與分組 NSCLC 細(xì)胞A549 常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基,將DLGAP1-AS2抑制表達(dá)載體質(zhì)粒及陰性對(duì)照、miR-1193 模擬物基因型及對(duì)照轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞,記為si-DLGAP1-AS2 組、si-NC組、miR-1193組、miR-NC組;將DLGAP1-AS2抑制表達(dá)載體質(zhì)粒分別與miR-1193 抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞,記為si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193組、si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC組。

      1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)DLGAP1-AS2 和miR-1193 的表達(dá)水平 提取癌組織及細(xì)胞總RNA,合成cDNA后以其為模板按SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR,以GAPDH 和U6為內(nèi)參。PCR 反應(yīng)體系:2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μl、7 μl 無(wú)菌水;循環(huán)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40 個(gè)循環(huán);熔解曲線:95 ℃15 s,60 ℃15 s,95 ℃15 s。相對(duì)表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計(jì)算。DLGAP1-AS2正向引物:5'-ACACGGTGAAACCCTGTCTC-3',反向引物:5'-GGAGAACAATGGCGTGATCT-3';GAPDH正向引物:5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3',反向引物:5'-CAGGTCACATACACGGTTGC-3';miR-1193正向引物:5'-GGGATGGTAGACCGGTGACGTGC-3',反向引物:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';U6正向引物:5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3',反向引物:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

      1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT 溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去各孔液體,再加入200μl二甲基亞砜反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。

      1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成數(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml,將其接種于6 孔板,培養(yǎng)2 周出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng),甲醇固定后采用吉姆薩染色30 min,于低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落。

      1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次,加入300μl 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,然后加入5 μl Annexin V-FITC 和PI,混勻,避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

      1.2.6 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白,取部分蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,5%脫脂牛奶室溫封閉,加入cleavedcaspase3、cleaved-caspase9 一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,加入二抗在室溫下孵育2 h,曝光顯影、定影,分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

      1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 使用PCR 擴(kuò)增包含miR-1193 結(jié)合位點(diǎn)的DLGAP1-AS2 序列片段,并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中,獲得DLGAP1-AS2 野生型載體(WT-DLGAP1-AS2),將DLGAP1-AS2 序列AUUUCCAGAACAUACCAUCC 突變?yōu)镚UUGUAAU‐AAUAGCUAGGAU,獲得DLGAP1-AS2 突變型載體(MUT-DLGAP1-AS2),將WT-DLGAP1-AS2、MUTDLGAP1-AS2 分別與miR-NC、miR-1193 共轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h 后,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示,兩組間比較行t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá) NSCLC組織中DLGAP1-AS2表達(dá)水平高于癌旁組織,miR-1193 表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05,表1)。

      表1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá)(±s,n=49)Tab.1 Expressions of DLGAP1-AS2 and miR-1193 in NSCLC tissues(±s,n=49)

      表1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá)(±s,n=49)Tab.1 Expressions of DLGAP1-AS2 and miR-1193 in NSCLC tissues(±s,n=49)

      Note:Compared with adjacent tissues,1)P<0.05.

      miR-1193 1.00±0.06 0.34±0.031)68.871 0.000 Groups Adjacent tissues NSCLC tissues t P DLGAP1-AS2 1.00±0.08 4.52±0.311)76.962 0.000

      2.2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖的影響 與si-NC 組相比,si-DLGAP1-AS2 組DLGAP1-AS2 表達(dá)水平降低,A549 細(xì)胞活性降低,克隆形成數(shù)減少(P<0.05,表2)。

      表2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響(±s,n=9)Tab.2 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on proliferation of A549 cells(±s,n=9)

      表2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響(±s,n=9)Tab.2 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on proliferation of A549 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

      Cell clone formation 107.59±11.59 43.77±4.591)15.359 0.000 Groups DLGAP1-AS2 si-NC si-DLGAP1-AS2 t P 1.00±0.07 0.34±0.041)24.559 0.000 OD value(490 nm)0.83±0.06 0.43±0.041)16.641 0.000

      2.3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC 組相比,si-DLGAP1-AS2 組A549 細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-cas‐pase9蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05,圖1、表3)。

      圖1 抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell

      表3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=9)Tab.3 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell(±s,n=9)

      表3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響(±s,n=9)Tab.3 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell(±s,n=9)

      Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

      cleaved-cas‐pase9 protein 0.21±0.02 0.65±0.051)24.512 0.000 Groups si-NC si-DLGAP1-AS2 t P Apoptosis rate(%)7.12±0.68 24.19±2.211)22.119 0.000 cleaved-cas‐pase3 protein 0.31±0.03 0.78±0.061)21.019 0.000

      2.4 DLGAP1-AS2 靶向調(diào)控miR-1193 表達(dá) Star‐Base 預(yù)測(cè)顯示DLGAP1-AS2 的序列中含有與miR-1193 互補(bǔ)的核苷酸序列(圖2);WT-DLGAP1-AS2 與miR-1193 共轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05),MUT-DLGAP1-AS2 與miR-1193 共轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化(表4)。過(guò)表達(dá)DLGAP1-AS2 后miR-1193 表達(dá)水平降低,抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)后miR-1193 表達(dá)水平升高(P<0.05,表5)。

      圖2 DLGAP1-AS2與miR-1193互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.2 Complementary nucleotide sequence of DLGAP1-AS2 and miR-1193

      表4 miR-1193 與DLGAP1-AS2 野生型、突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性(±s,n=9)Tab.4 Luciferase activity after co-transfection of miR-1193 with DLGAP1-AS2 wild-type and mutant vector(±s,n=9)

      表4 miR-1193 與DLGAP1-AS2 野生型、突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性(±s,n=9)Tab.4 Luciferase activity after co-transfection of miR-1193 with DLGAP1-AS2 wild-type and mutant vector(±s,n=9)

      Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

      WT-DLGAP1-AS2 1.03±0.08 0.55±0.051)15.264 0.000 MUT-DLGAP1-AS2 1.02±0.07 1.00±0.05 0.697 0.496 Groups miR-NC miR-1193 t P

      表5 DLGAP1-AS2調(diào)控miR-1193的表達(dá)(±s,n=9)Tab.5 DLGAP1-AS2 regulates expression of miR-1193(±s,n=9)

      表5 DLGAP1-AS2調(diào)控miR-1193的表達(dá)(±s,n=9)Tab.5 DLGAP1-AS2 regulates expression of miR-1193(±s,n=9)

      Note:Compared with pcDNA group,1)P<0.05;compared with si-NC group,2)P<0.05.

      miR-1193 1.00±0.07 0.41±0.031)0.99±0.04 2.58±0.212)606.874 0.000 Groups pcDNA pcDNA-DLGAP1-AS2 si-NC si-DLGAP1-AS2 F P

      2.5 miR-1193 過(guò)表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組相比,miR-1193 組A549細(xì)胞活性降低,克隆形成數(shù)減少,細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9 表達(dá)水平升高(P<0.05,圖3、表6)。

      表6 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.6 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of A549 cells(±s,n=9)

      表6 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.6 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of A549 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

      cleaved-caspase9 protein 0.22±0.02 0.59±0.051)20.612 0.000 Groups miR-1193 OD value(490 nm)Cell clone formation Apoptosis rate(%)miR-NC miR-1193 t P 1.00±0.06 3.74±0.211)37.637 0.000 0.85±0.07 0.53±0.041)11.907 0.000 109.07±12.68 56.24±4.081)11.898 0.000 6.77±0.64 19.61±1.891)19.304 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.29±0.03 0.72±0.051)22.123 0.000

      圖3 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-1193 overexpression on apoptosis of A549 cells

      2.6 干擾miR-1193 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC 組相比,si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193 組A549 細(xì)胞活性升高,A549 細(xì)胞的克隆形成數(shù)增加,細(xì)胞凋亡率及cleaved-cas‐pase3、cleaved-caspase9 表達(dá)水平降低(P<0.05,圖4、表7)。

      圖4 干擾miR-1193 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的作用Fig.4 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on apoptosis of A549 cells

      表7 干擾miR-1193表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用(±s,n=9)Tab.7 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on proliferation and apoptosis of A549 cells(±s,n=9)

      表7 干擾miR-1193表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用(±s,n=9)Tab.7 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on proliferation and apoptosis of A549 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC group,1)P<0.05.

      cleaved-caspase9 protein 0.67±0.05 0.32±0.041)16.398 0.000 Groups miR-1193 si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193 t P 1.00±0.07 0.26±0.021)30.494 0.000 OD value(490 nm)0.42±0.04 0.75±0.051)15.461 0.000 Cell clone formation 41.92±4.11 84.05±7.381)14.962 0.000 Apoptosis rate(%)26.23±2.18 13.79±1.261)14.822 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.79±0.05 0.41±0.041)17.804 0.000

      3 討論

      靶向治療的出現(xiàn)使NSCLC 的治療方式發(fā)生巨大變化,改善了患者的生活質(zhì)量及生存期,深入研究NSCLC 機(jī)制,開發(fā)新的靶點(diǎn)對(duì)其靶向治療具有重要意義[8-9]。lncRNA 和miRNA 均屬于非編碼RNA,研究表明,非編碼RNA 可作為可靠的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo),從而促進(jìn)更有效的癌癥治療和更好的患者預(yù)后生存[10]。研究報(bào)道DLGAP1-AS2 與Wilms 患者的生存率顯著相關(guān),可作為其預(yù)后標(biāo)志物[11]。DLGAP1-AS2 的高表達(dá)與膽管癌患者的不良預(yù)后相關(guān);DLGAP1-AS2 通過(guò)調(diào)控miR-505 和GALNT10 促進(jìn)膽管癌進(jìn)展[12]。DLGAP1-AS2 在胃癌患者癌組織及血漿中的表達(dá)水平均明顯升高;敲減DLGAP1-AS2 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NSCLC 組織中DLGAP1-AS2 表達(dá)水平升高,提示DLGAP1-AS2 可能在NSCLC 中發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)后,A549 細(xì)胞活性降低,克隆形成數(shù)減少,A549細(xì)胞凋亡率升高,cleaved-caspase3、cleaved-caspase9 蛋白表達(dá)水平升高,表明抑制DLGAP1-AS2表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示DLGAP1-AS2 在肺癌中與在其他癌癥中的作用一致??赡茏鳛榉伟z測(cè)、治療的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

      研究報(bào)道m(xù)iR-1193 的強(qiáng)制表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14]。miR-1193 還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]。說(shuō)明miR-1193在不同癌癥中均發(fā)揮抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NSCLC 組織中miR-1193 表達(dá)水平降低;提示miR-1193 或與NSCLC 的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)miR-1193 后A549 細(xì)胞活性降低,克隆形成數(shù)減少,A549細(xì)胞凋亡率升高,cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平升高,表明過(guò)表達(dá)miR-1193 可抑制A549 細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;提示miR-1193 在NSCLC 中同樣起抑癌基因作用。且本研究發(fā)現(xiàn)DLGAP1-AS2 可靶向調(diào)控miR-1193;而干擾miR-1193 表達(dá)則減弱了抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用。提示DLGAP1-AS2可能通過(guò)調(diào)控miR-1193影響NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡。

      綜上所述,抑制lncRNA DLGAP1-AS2表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)miR-1193 抑制NSCLCA549 細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡。

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