補(bǔ)中益氣湯對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤PI3K/AKT信號(hào)通路的影響①

王 瑩 張 穎 高 原 王 淳 劉春英 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽(yáng) 110847）

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂酰肌醇3 激酶（phosphati‐dylinositol 3 kinase，PI3K）與其下游分子蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）組成的信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。PI3K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞生存和增殖的主要通路，活化的PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)激發(fā)下游多種蛋白磷酸化而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，貫穿腫瘤發(fā)展過(guò)程的始終［3］。目前以PI3K/AKT 信號(hào)通路為靶點(diǎn)的腫瘤治療得到了密切關(guān)注，并在深入挖掘中。

有報(bào)道稱(chēng)，PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度活化或激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥；PI3K/AKT通路具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal tran‐sition，EMT）進(jìn)程的作用，其活性增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［4］。由此可推測(cè)PI3K/AKT 信號(hào)通路可能是腫瘤細(xì)胞EMT與耐藥的共同信號(hào)通路。

前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，A549/DDP 細(xì)胞荷瘤裸鼠EMT 與耐藥存在明顯相關(guān)性，補(bǔ)中益氣湯具有干預(yù)肺腺癌荷瘤裸鼠EMT，改善順鉑耐藥作用。本實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1 過(guò)表達(dá)的A549/DDP 細(xì)胞制備荷瘤裸鼠，補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合PI3K 通路抑制劑（LY294002）共同干預(yù)后，檢測(cè)PI3K、AKT 和EMT 分子標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、N-鈣黏蛋白（N-cad‐herin，N-cad）在蛋白和基因水平上的表達(dá)，探求補(bǔ)中益氣湯干預(yù)EMT 改善肺腺癌順鉑耐藥是否與PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)，為補(bǔ)中益氣湯臨床治療肺腺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 SPF 級(jí)雄性BALB/c 裸鼠36 只，6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（遼）2013-0009。肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP購(gòu)于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 補(bǔ)中益氣湯由黃芪18 g、白術(shù)9 g、人參6 g、升麻6 g、橘皮6 g、柴胡6 g、當(dāng)歸3 g、甘草9 g組成，以上飲片均購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。依據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算裸鼠等效劑量，按前期實(shí)驗(yàn)篩選的最佳用藥劑量，即成人日推薦量的2 倍劑量（5.84 g/kg 生藥）［5］，常規(guī)煎煮，水浴蒸發(fā)至1 g/ml 生藥，4 ℃保存，備用。順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 主要試劑 LY294002購(gòu)于阿拉丁公司；Anti-E-cad、Anti-N-cad 購(gòu)于美國(guó)Santa 公司；Anti-p-PI3K、Anti-p-AKT（Ser473）購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Anti-PI3K、Anti-AKT 購(gòu)于武漢三鷹技術(shù)有限公司；生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG、生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、ECL 檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）、內(nèi)參抗體β-actin購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；PVDF 膜購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司；TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix 購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 移植瘤模型的制備、分組及給藥 36 只BALB/c 裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空載組（NG 組）、模型組（MG 組）、順鉑組（DDP 組）、補(bǔ)中益氣湯+順鉑組（BCD 組）、順鉑+阻滯劑LY294002 組（DLY 組）、補(bǔ)中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002 組（BCDLY 組），共計(jì)6 組。TGF-β1 空載A549/DDP細(xì)胞、TGF-β1過(guò)表達(dá)A549/DDP細(xì)胞分別制備細(xì)胞懸液，各取100μl（約含1×107個(gè)細(xì)胞）分別接種于裸鼠左側(cè)腋窩皮下。NG組接種TGF-β1空載A549/DDP 細(xì)胞，其余組接種TGF-β1 過(guò)表達(dá)A549/DDP 細(xì)胞。自接種當(dāng)日起每天觀察裸鼠狀態(tài)及腫瘤生長(zhǎng)情況。6 組裸鼠一般狀況良好，均在接種后8 d 觀察到注射部位皮下有直徑2~3 mm 的腫瘤結(jié)節(jié)，說(shuō)明接種成功，各組致瘤率均達(dá)100%。細(xì)胞接種8 d 后開(kāi)始給藥。NG 組和MG 組腹腔注射生理鹽水0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2次/d；DDP 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2 次/d；BCD 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃補(bǔ)中益氣湯，1 ml/次，2次/d；DLY 組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃生理鹽水，1 ml/次，2次/d；BCDLY組腹腔注射順鉑0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃補(bǔ)中益氣湯，1 ml/次，2 次/d。細(xì)胞接種32 d 后處死裸鼠，取腫瘤組織固定、凍存。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 表達(dá) 切片脫蠟至水，微波加熱修復(fù)抗原。滴加3%H2O2室溫孵育15 min。滴加山羊血清室溫孵育15 min。4 ℃孵育一抗工作液（E-cad、N-cad 1∶50；PI3K、AKT 1∶100；p-PI3K、p-AKT 1∶400）過(guò)夜。37 ℃孵育二抗工作液30 min（1∶200）。滴加HRP 標(biāo)記的親和素（1∶200），37 ℃孵育30 min。滴加100μl顯色試劑，待顏色剛剛變深，迅速置于水中終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。PI3K蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)深染的棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果；AKT 蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上出現(xiàn)深染的棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果；E-cad蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)深染的棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果；N-cad 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上出現(xiàn)深染的棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3 Western blot檢測(cè)移植瘤PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達(dá) 將腫瘤組織搗碎，使用RIPA∶PMSF（100∶1）裂解液裂解，離心提取總蛋白。采用BSA 蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。上樣，SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉。4 ℃過(guò)夜孵育一抗（AKT 1∶500；PI3K、p-PI3K、p-AKT 1∶1 000）。37 ℃孵育二抗（1∶5 000），45 min 后發(fā)光、拍照，Quantity One 凝膠圖像分析。

1.2.4 RT-qPCR 檢測(cè)移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT mRNA 表達(dá) 采用TRIpure 裂解液提取細(xì)胞總RNA，檢驗(yàn)樣本RNA 純度，計(jì)算RNA 濃度（g/L）。RNA 濃度=A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分析方法采用2?ΔΔCt法。RT-qPCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物Tab.1 PCR primer sequences and amplification products

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白的表達(dá) 各組間PI3K、AKT蛋白表達(dá)差異較小。p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)組間差異性較大，與NG組相比，MG組p-PI3K、p-AKT 蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增多；與MG、DDP組相比，BCD、DLY、BCDLY 組p-PI3K、p-AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)逐漸減少，BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白陽(yáng)性減少最為顯著。免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達(dá)（IHC，×400）Fig.1 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（IHC，×400）

各組PI3K、AKT 蛋白表達(dá)略有差異，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)組間差異較大，與NG 組相比，MG 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)明顯增多（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與DLY 組相比，BCDLY 組p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot條帶及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達(dá)（±s，n=6）Fig.2 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（±s，n=6）

2.2 各組移植瘤PI3K、AKT mRNA 表達(dá) 與NG 組相比，MG 組PI3K mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組PI3K mRNA 表達(dá)均有不同程度的下調(diào)（P<0.05）；與DLY組相比，BCDLY 組PI3K mRNA 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。各組間AKT mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組移植瘤PI3K、AKT mRNA表達(dá)（±s，n=6）Fig.3 mRNA expressions of xenograft PI3K and AKT in each group（±s，n=6）

2.3 各組移植瘤E-cad、N-cad 蛋白表達(dá) E-cad、N-cad 蛋白的陽(yáng)性著色各組均有表達(dá)。與NG 組相比，MG 組上皮分子E-cad 蛋白表達(dá)明顯減少，間質(zhì)蛋白N-cad 蛋白表達(dá)明顯增多；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組上皮分子E-cad 蛋白表達(dá)逐漸增多，間質(zhì)蛋白N-cad蛋白表達(dá)逐漸減少；與DLY 組相比，BCDLY 組上皮分子E-cad蛋白表達(dá)增多，間質(zhì)蛋白N-cad蛋白表達(dá)減少。見(jiàn)圖4。

圖4 各組移植瘤E-cad、N-cad蛋白表達(dá)（IHC，×400）Fig.4 Expressions of xenograft E-cad and N-cad protein in each group（IHC，×400）

2.4 各組移植瘤E-cad、N-cad mRNA 表達(dá) 與NG組相比，MG 組上皮分子E-cad mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)，N-cad mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；與MG、DDP 組相比，BCD、DLY、BCDLY 組上皮分子E-cad mRNA 表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，N-cad mRNA 表達(dá)均有不同程度下調(diào)（P<0.05）；與DLY組相比，BCDLY組上皮分子E-cad mRNA 表達(dá)增多，間質(zhì)蛋白N-cad mRNA表達(dá)減少。見(jiàn)圖5。

圖5 各組移植瘤E-cad、N-cad mRNA表達(dá)（±s，n=6）Fig.5 Expressions of xenograft E-cad and N-cad mRNA in each group（±s，n=6）

3 討論

PI3K/AKT是腫瘤中最重要的信號(hào)通路，直接關(guān)系到細(xì)胞的活化、增殖、癌變、凋亡等過(guò)程［6］。在已知的多種癌癥中，過(guò)度活化的PI3K/AKT 通路因減少了細(xì)胞程序性死亡而促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞EMT 呈正相關(guān)，PI3K/AKT 信號(hào)通路的狀態(tài)改變，腫瘤細(xì)胞的EMT會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)變化，其主要機(jī)制與PI3K/AKT 信號(hào)通路活化引起細(xì)胞間黏附能力下降有關(guān)［7］。

PI3K 可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)，目前的研究熱點(diǎn)主要是Ⅰ類(lèi)，由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 構(gòu)成，與v-Sre、v-Ras 等癌基因的產(chǎn)物相關(guān)［8］。P13K 既有蘇氨酸（Thr）/絲氨酸（Ser）激酶活性，也有磷脂酰肌醇激酶活性。PI3K激活后，其p110亞基催化在質(zhì)膜上激活第二信使PIP3，觸發(fā)PIP3 與信號(hào)蛋白AKT、PDK1 結(jié)合，引起AKT 蛋白磷酸化。AKT 是PI3K 最重要的下游效應(yīng)蛋白，活化的AKT 通過(guò)介導(dǎo)下游多個(gè)靶蛋白的磷酸化調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，發(fā)揮抗凋亡作用［9］。AKT 活化涉及兩個(gè)殘基的磷酸化：激活回路上的蘇氨酸308（Thr308）和C 端疏水基序中的絲氨酸473（Ser473）。在腫瘤細(xì)胞系中，使用PI3K 特異性抑制劑LY294002 可抑制AKT 功能，以p-AKT（Ser473）表達(dá)含量降低為主要指標(biāo)［10］。隋華等［11］證實(shí)阻斷PI3K/AKT 信號(hào)通路可改善人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT-116/L-OHP 的藥敏性，逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腸癌多藥耐藥。

本課題組前期研究證實(shí)，補(bǔ)中益氣湯有調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路表達(dá)，改善腫瘤順鉑耐藥的作用［12］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯含藥血清可通過(guò)干預(yù)A549/DDP 細(xì)胞EMT 改善其順鉑耐藥［13］。鑒于PI3K/AKT 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、耐藥等過(guò)程密切相關(guān)，本研究以通路阻滯劑LY294002 為對(duì)照，通過(guò)分子生物學(xué)手段驗(yàn)證補(bǔ)中益氣湯對(duì)肺腺癌荷瘤裸鼠PI3K/AKT 信號(hào)通路及EMT 分子標(biāo)志物E-cad、N-cad表達(dá)的影響，以明確補(bǔ)中益氣湯對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。

免疫組化、Western blot 同時(shí)檢測(cè)PI3K、AKT 蛋白和p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與空載組相比，模型組p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平均升高；與模型組相比，補(bǔ)中益氣湯組、順鉑+阻滯劑LY294002 組、補(bǔ)中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002組p-PI3K、p-AKT蛋白水平均有不同程度的降低，證實(shí)補(bǔ)中益氣湯可通過(guò)下調(diào)PI3K 磷酸化水平抑制AKT 活化。補(bǔ)中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002 組效果最佳，與順鉑+阻滯劑LY294002 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示補(bǔ)中益氣湯與LY294002 有協(xié)同效果，可共同作用于PI3K/AKT 通路，抑制其表達(dá)。各組PI3K、AKT 總蛋白表達(dá)幾乎無(wú)變化，而p-PI3K、p-AKT 有變化，再次證實(shí)補(bǔ)中益氣湯影響PI3K/AKT通路的活化過(guò)程。RT-qPCR 檢測(cè)PI3K、AKT mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與空載組相比，模型組PI3K mRNA表達(dá)水平升高；與模型組相比，各治療組PI3K mRNA 水平均有不同程度的降低，順鉑+阻滯劑LY294002 組、補(bǔ)中益氣湯+順鉑+阻滯劑LY294002組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LY294002 競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ATP 與PI3K 激酶催化亞單位p110 的結(jié)合，是在蛋白水平上對(duì)PI3K磷酸化的抑制。由此推測(cè)，補(bǔ)中益氣湯的作用靶點(diǎn)可能是在PI3K 基因水平上的某一位點(diǎn)，是通過(guò)減少PI3K mRNA 表達(dá)抑制PI3K 蛋白質(zhì)的合成。各組間AKT mRNA 變化不顯著，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)補(bǔ)中益氣湯和LY294002 只能抑制AKT 蛋白磷酸化，但并不影響其基因表達(dá)。這一結(jié)論與既往研究一致［14］。

EMT 是指上皮細(xì)胞在特定的生理、病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象［15］。研究表明，腫瘤細(xì)胞EMT 與腫瘤耐藥密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生EMT 的過(guò)程中，細(xì)胞極性喪失，可獲得更高的轉(zhuǎn)移與侵襲能力［16］。E-cad 和N-cad 是EMT 的主要分子標(biāo)志物［17］。TGF-β 是一種多肽性細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控因子，為腫瘤細(xì)胞EMT 的主要誘導(dǎo)因子，與多種上皮性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中以TGF-β1 最常見(jiàn)，活性也最強(qiáng)［18-19］。

TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 的過(guò)程與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，如：Notch、Hippo、Smad、PI3K/AKT 等［20-23］。其中，PI3K/AKT 被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞EMT 最重要的信號(hào)通路之一［24-25］。PI3K/AKT 通路的激活與TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞EMT 呈正相關(guān)［26-27］。研究表明，PI3K/AKT 信號(hào)通路被TGF-β1 激活后，促使TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使用PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制劑阻止其激活，肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 的過(guò)程隨之顯著降低［28-29］。李優(yōu)等［30］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 通路激活進(jìn)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT。

本研究發(fā)現(xiàn)，與TGF-β1空載組相比，TGF-β1過(guò)表達(dá)的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤模型組PI3K、AKT 總蛋白表達(dá)變化較小，而活化的p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)明顯增多，提示PI3K/AKT 通路被TGF-β1 激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯的藥物組PI3K、AKT總蛋白表達(dá)變化較小，而p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)明顯減少，與PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002 的作用相似，提示補(bǔ)中益氣湯可抑制TGF-β1 對(duì)PI3K/AKT 通路的激活。上述研究中，各組EMT 分子標(biāo)志物E-cad 和N-cad 蛋白及mRNA 表達(dá)與PI3K/AKT 信號(hào)通路激活變化呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明補(bǔ)中益氣湯可通過(guò)抑制TGF-β1 激活PI3K/AKT 通路，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。綜上所述，補(bǔ)中益氣湯改善肺腺癌順鉑耐藥的機(jī)制可能與其抑制TGF-β1對(duì)肺腺癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制EMT有關(guān)。

肺癌術(shù)后及放化療患者具有“正虛邪衰”的特點(diǎn)，重在提高機(jī)體免疫力。隨著現(xiàn)代治療技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，免疫治療逐漸成為腫瘤治療新焦點(diǎn)［31］。抗腫瘤免疫治療與中醫(yī)“扶正培本”抗癌理念相契合，補(bǔ)中益氣湯恰是“扶正培本”的代表方劑，具有扶助正氣，促進(jìn)氣血生化，兼以祛邪的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，補(bǔ)中益氣湯中的有效化學(xué)成分包括多糖、生物堿、皂苷、揮發(fā)油等，無(wú)論復(fù)方還是方中的單味藥提取物均可表現(xiàn)出多個(gè)藥理作用靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)免疫功能可能是其中之一。臨床應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯可提高機(jī)體免疫功能，減輕化療的消化道反應(yīng)，促進(jìn)術(shù)后機(jī)體恢復(fù)，改善營(yíng)養(yǎng)狀況等［32-33］。肺癌在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與機(jī)體的免疫功能有十分密切的相互作用。當(dāng)外周血中的免疫細(xì)胞處于平衡狀態(tài)時(shí)，肺癌患者的預(yù)后最佳［34］。陳記財(cái)?shù)龋?5］研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯可改善非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK 細(xì)胞水平，降低白細(xì)胞減少的發(fā)生率。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯可下調(diào)A549 荷瘤裸鼠脾臟中Fas 蛋白表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷［36］。補(bǔ)中益氣湯是否能進(jìn)一步調(diào)節(jié)肺腺癌A549/DDP 荷瘤裸鼠的免疫功能或改善其腫瘤微環(huán)境，其具體作用機(jī)制如何，值得進(jìn)一步探討，以期為補(bǔ)中益氣湯臨床抗腫瘤應(yīng)用提供確切的理論依據(jù)。