SNHG3調(diào)控miR-186對過氧化氫處理的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

鄭 婉 林 云 左 琦 林燕仔 顏亞妮 符碧薇

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570102）

血管內(nèi)皮細胞是組織和血液的直接屏障，血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化等心腦血管疾病發(fā)生的重要原因，因此，保護血管內(nèi)皮細胞免受損傷對防治動脈粥樣硬化起重要作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA 異常表達參與調(diào)控動脈粥樣硬化進展，有望成為心血管疾病的新型診斷標(biāo)志物或藥物治療靶點［2］。研究報道，小核仁RNA 宿主基因3（small nu‐cleolar RNA host gene 3，SNHG3）參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，如SNHG3 高表達與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)，且促進卵巢癌細胞增殖、侵襲及惡性進展［3］。SNHG3 過表達與患者總體生存和無轉(zhuǎn)移生存的不良預(yù)后相關(guān)，促進胃癌細胞遷移、侵襲及肺轉(zhuǎn)移［4］。研究表明，miRNA 參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等功能，通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞參與動脈粥樣硬化等心血管疾病過程［5-6］。miR-186在高危患者血清中高表達，可反映動脈粥樣硬化性心血管疾病嚴重程度［7］。miR-186 通過抑制胱硫醚-γ-裂解酶表達降低內(nèi)源性H2S 含量，促進巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和促炎因子分泌，可能與動脈粥樣硬化有關(guān)［8］。抑制miR-186表達通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-α）減輕缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞線粒體損傷［9］。但SNHG3 對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響及機制尚不清楚，本研究采用過氧化氫處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞Eahy926建立血管內(nèi)皮細胞損傷模型，探究SNHG3對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響及其機制是否與miR-186有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株Eahy926（上海信裕生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；熒光定量試劑盒（美國Progema 公司）；RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒、凋亡試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；重組Anti-CyclinD1 抗體（ab134175）、重組Anti-P21 抗體（ab109520）、重組Anti-Bax 抗體（ab32503）、重組Anti-Bcl-2 抗體（ab182858）、山羊抗兔IgG H&L（HRP，ab6721，美國Abcam 公司）；PowerPac 蛋白電泳儀、Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 Eahy926 細胞采用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)，80% 融和時采用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，500 mmol/L過氧化氫培養(yǎng)細胞24 h作為過氧化氫組（H2O2），正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。將pcDNA-3.1、pcDNA3.1-SNHG3 轉(zhuǎn)染至Eahy926 細胞，再采用500 mmol/L過氧化氫處理，記為H2O2+pcDNA3.1組、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 組。將pcDNA3.1-SNHG3與miR-NC、miR-186 分別共轉(zhuǎn)染至Eahy926 細胞，再采用500 mmol/L H2O2處理，記為H2O2+pc-DNA3.1-SNHG3+miR-NC 組、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186組。

1.2.2 RT-qPCR 檢測SNHG3 和miR-186 表達 提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按熒光定量PCR 試劑盒說明操作，循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)，2?ΔΔCt法計算相對表達。SNHG3 和miR-186 分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，SNGH3 正向引物：5'-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3'，反向引物：5'-TCCTTAACAAATCCAAGGAGAAGAA-3'；miR-186 正向引物：5'-GCCGAGCAAAGAATTCTCCTTT-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；GAPDH 正向引物：5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3'，反向引物：5'-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，反向引物：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。

1.2.3 Western blot 檢測細胞CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉，加入一抗孵育過夜，加入二抗孵育2 h，曝光顯影、定影，測定蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶比值作為蛋白表達。

1.2.4 MTT 檢測細胞存活率 收集各組對數(shù)生長期細胞于96 孔板培養(yǎng)48 h，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液及10 μl MTT 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度（OD）值，細胞存活率（%）=OD實驗組/OD空白對照組×100%。

1.2.5 SOD 和LDH 試劑盒分別檢測細胞SOD 活性和培養(yǎng)液LDH 含量 細胞培養(yǎng)48 h 后收集各組細胞及培養(yǎng)上清，在細胞沉淀中加入PBS緩沖液，進行冰水?。?00 W，超聲3~5 s/次，間隔4 次，每次間隔30 s）。采用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度，按試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，混勻，37 ℃孵育20 min，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，計算SOD活力或LDH含量。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集細胞，1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106~5×106個/ml，取100 μl 細胞懸浮液于流式管，加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC 混勻，室溫避光孵育5 min，加入5 μl PI，并加入400 μl PBS，流式細胞儀檢測，細胞凋亡率（%）=早期和晚期凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.7 熒光素酶報告實驗檢測SNHG3 對miR-186的靶向調(diào)控 構(gòu)建野生型和突變型SNHG3 的熒光素酶表達載體WT-SNHG3 和MUT-SNHG3，分別與miR-NC 和miR-186 共轉(zhuǎn)染至Eahy926 細胞，充分裂解細胞后加至培養(yǎng)板，配制螢火蟲熒光素酶反應(yīng)工作液和海腎熒光素酶反應(yīng)液，并孵育至室溫，加入100μl 螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液振蕩混勻，檢測螢火蟲熒光素酶活力，加入100μl 海腎熒光素酶反應(yīng)液振蕩混勻，檢測海腎熒光素酶活力。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-SNHG3、si-NC、si-SNHG3 分別轉(zhuǎn)染至正常Eahy926細胞，按1.2.2檢測miR-186表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2處理的Eahy926 細胞SNHG3 表達 與對照組相比，H2O2處理的Eahy926 細胞SNHG3 表達比未采用處理H2O2處理的Eahy926 細胞顯著降低（0.23±0.02vs1.01±0.10，t=22.946，P<0.001）。

2.2 過表達SNHG3 對H2O2處理的Eahy926 細胞活性及SOD、LDH 的影響 與對照組相比，H2O2處理的Eahy926 細胞SNHG3、CyclinD1 表達顯著降低，P21 表達顯著升高，存活率顯著降低，SOD 活性顯著降低，LDH 水平顯著升高（P<0.05）；與H2O2+pcDNA 3.1 組相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 組Eahy926 細胞SNHG3、CyclinD1 表達顯著升高，P21 表達顯著降低，存活率顯著升高，SOD 活性顯著升高，LDH 水平顯著降低（P<0.05，表1、圖1）。

表1 過表達SNHG3對H2O2處理的Eahy926細胞活性及SOD、LDH的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of overexpression of SNHG3 on cell viability and SOD and LDH of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表1 過表達SNHG3對H2O2處理的Eahy926細胞活性及SOD、LDH的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of overexpression of SNHG3 on cell viability and SOD and LDH of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with H2O2+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

LDH/（U·L?1）468.26±53.50 1 468.11±140.281）1 454.57±139.31 661.25±73.842）208.246<0.001 Groups Control H2O2 H2O2+pcDNA3.1 H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 F P SNHG3 1.02±0.10 0.24±0.021）0.22±0.02 0.71±0.072）345.076<0.001 CyclinD1 0.67±0.07 0.17±0.021）0.19±0.02 0.50±0.052）261.476<0.001 P21 0.20±0.02 0.78±0.081）0.75±0.07 0.34±0.032）243.119<0.001 Survival rate（%）100.07±8.25 42.28±4.131）42.61±4.25 88.27±6.822）220.061<0.001 SOD/（U·mg?1·prot?1）32.18±2.96 17.06±1.621）16.94±1.57 28.29±2.612）106.125<0.001

圖1 過表達SNHG3對H2O2處理的Eahy926細胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響Fig.1 Effect of overexpression of SNHG3 on proliferation related proteins expressions in H2O2-treated Eahy-926 cells

2.3 過表達SNHG3 對H2O2處理的Eahy926 細胞凋亡的影響 與對照組相比，H2O2處理的Eahy926 細胞Bax 表達顯著升高，Bcl-2 表達顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與H2O2+pcDNA3.1 組相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 組Eahy926 細胞Bax 表達顯著降低，Bcl-2 表達顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P<0.05，圖2、表2）。

圖2 過表達SNHG3 對H2O2 處理的Eahy926 細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2

表2 過表達SNHG3 對H2O2 處理的細胞Eahy926 凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表2 過表達SNHG3 對H2O2 處理的細胞Eahy926 凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with H2O2+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

Groups Control H2O2 H2O2+pcDNA3.1 H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 Bax 0.13±0.01 0.71±0.071）0.70±0.07 0.25±0.022）Bcl-2 0.81±0.08 0.25±0.021）0.27±0.03 0.65±0.072）Apoptosis rate（%）8.01±1.10 26.66±2.751）26.19±2.53 14.04±1.382）179.497<0.001 F P 317.447<0.001 222.762<0.001

2.4 SNHG3 靶向調(diào)控miR-186 表達 starbase 預(yù)測顯示，SNHG3 與miR-186 存在結(jié)合位點（圖3）。miR-186 與WT-SNHG3 共轉(zhuǎn)染的Eahy926 細胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而與MUT-SNHG3 共轉(zhuǎn)染的Eahy926細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表3）。相較于pcDNA3.1 組，pcDNA 3.1-SNHG3 組miR-186 表達顯著降低，相較于si-NC組，si-SNHG3 組miR-186 表達顯著升高（P<0.05，表4）。提示SNHG3可靶向調(diào)控miR-186表達。

表3 雙熒光素酶實驗（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase experiment（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶實驗（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-SNHG3 0.95±0.10 1.02±0.10 1.485>0.05 Groups miR-NC miR-186 t P WT-SNHG3 1.00±0.10 0.37±0.041）17.548<0.001

表4 SNHG3調(diào)控miR-186表達（±s，n=9）Tab.4 SNHG3 regulates expression of miR-186（±s，n=9）

表4 SNHG3調(diào)控miR-186表達（±s，n=9）Tab.4 SNHG3 regulates expression of miR-186（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-186 0.98±0.10 0.33±0.031）0.95±0.10 1.66±0.162）228.594<0.001 Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-SNHG3 si-NC si-SNHG3 F P

2.5 過表達miR-186 可逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2處理的Eahy926 細胞活性及SOD、LDH 的影響 與H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC 組相比，H2O2+pcDNA-3.1-SNHG3+miR-186 組Eahy926 細胞miR-186、CyclinD1 表達顯著降低，P21 表達顯著升高，細胞存活率顯著降低，SOD 活性顯著降低，LDH 水平顯著升高（P<0.05，圖4、表5）。

圖4 過表達miR-186 逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2處理的Eahy926細胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Overexpression of miR-186 reverses effect of SNHG3 on expressions of proliferation related proteins in H2O2 treated Eahy926 cells

表5 過表達miR-186可逆轉(zhuǎn)SNHG3對H2O2處理的Eahy926細胞活性及SOD、LDH的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on viability and SOD and LDH of H2O2 treated Eahy926 cells（±s，n=9）

表5 過表達miR-186可逆轉(zhuǎn)SNHG3對H2O2處理的Eahy926細胞活性及SOD、LDH的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on viability and SOD and LDH of H2O2 treated Eahy926 cells（±s，n=9）

Note：Compared with H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC group，1）P<0.05.

LDH/（U·L?1）681.70±71.55 1 317.26±124.291）13.295<0.001 Groups H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186 t P miR-186 0.97±0.10 0.37±0.041）16.713<0.001 CyclinD1 0.48±0.05 0.22±0.021）14.484<0.001 P21 0.31±0.03 0.64±0.061）14.758<0.001 Survival rate（%）87.95±7.12 44.67±4.391）15.523<0.001 SOD/（U·mg?1·prot?1）27.96±2.73 17.18±1.691）10.072<0.001

2.6 過表達miR-186 可逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2處理的Eahy926 細胞凋亡的影響 與H2O2+pcDNA3.1-SN‐HG3+miR-NC 組相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186組Eahy926細胞Bax表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P<0.05，圖5、表6）。

圖5 過表達miR-186 可逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2處理的Eahy-926細胞凋亡的影響Fig.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2

表6 過表達miR-186 能逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2 處理的細胞Eahy926凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表6 過表達miR-186 能逆轉(zhuǎn)SNHG3 對H2O2 處理的細胞Eahy926凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186 Bax 0.23±0.02 Bcl-2 0.66±0.07 Apoptosis rate（%）13.89±1.35 0.59±0.061）0.31±0.031）24.14±2.231）11.796<0.001 t P 17.076<0.001 13.787<0.001

3 討論

血管內(nèi)皮細胞損傷是引起一系列心血管疾病的重要原因，對人類身體健康危害極大［10］。細胞凋亡是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷的主要原因，氧化應(yīng)激也與血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)［11］。SOD 是清除自由基的抗氧化酶，其活性高低反映機體抗氧化能力大??；LDH 是一種糖酵解酶，其漏出量反映細胞膜受損程度［12］。本研究采用H2O2處理Eahy926 細胞，結(jié)果顯示，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，SOD 活性顯著降低，LDH 水平顯著升高，說明血管內(nèi)皮細胞損傷模型建立成功。

研究報道，SNHG3 上調(diào)通過沉默Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子2（kruppel-like factor 2，KLF2）和P21 促進膠質(zhì)瘤細胞增殖，并抑制細胞凋亡，促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性進展［13］。SNHG3 通過miR-182-5p 促進結(jié)直腸癌惡性發(fā)展［14］。SNHG3 過表達可防止體內(nèi)缺氧/缺血性腦損傷和體外海馬細胞損傷［15］。lncRNA SNHG3通過充當(dāng)miR-485 的ceRNA 上調(diào)ATG7 表達，從而促進自噬誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞凋亡［16］。提示SNHG3不僅參與調(diào)控重力進展，還影響細胞缺氧損傷。本研究顯示，過氧化氫處理的Eahy926 細胞SNHG3 表達顯著降低，過表達SNHG3 后，細胞存活率顯著升高，凋亡率顯著降低，SOD 活性顯著升高，LDH 水平顯著降低，CyclinD1、Bax 表達降低，P21、Bcl-2 表達升高，表明過表達SNHG3 可促進Eahy926 細胞存活，抑制過氧化氫處理的Eahy926細胞凋亡，抑制氧化應(yīng)激。提示過表達SNHG3 可保護過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞miR-186表達明顯升高，干擾其表達可對細胞損傷起一定保護作用［9］。miR-186-5p 通過靶向Toll 樣受體3（Tolllike receptor 3，TLR3）調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡［17］。hsa_circ_0010729 通過靶向miR-186/HIF-1α調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡［18］。lncRNA SNHG16通過調(diào)節(jié)miR-186 表達促進肝癌增殖、遷移和侵襲［19］。表明miR-186參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞凋亡及損傷等過程，且miR-186 可受lncRNA 和circRNA 調(diào)控。為研究lncRNA SNHG3 是否與miR-186 具有調(diào)控關(guān)系，本研究通過在線軟件預(yù)測顯示，lncRNA SNHG3 與miR-186 存在結(jié)合位點，且通過雙熒光素酶報告實驗證實SNHG3 靶向調(diào)控miR-186 表達，同時過表達miR-186和lncRNA SNHG3，H2O2處理的細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率升高，SOD 活性顯著降低，LDH 水平顯著升高，表明過表達miR-186逆轉(zhuǎn)了SNHG3 對H2O2處理的Eahy926 細胞活性、凋亡及SOD、LDH 的影響。提示SNHG3 可能通過調(diào)控miR-186保護過氧化氫誘導(dǎo)的Eahy926細胞損傷。

綜上，過表達SNHG3 可能通過下調(diào)miR-186 表達保護過氧化氫誘導(dǎo)的Eahy926細胞損傷。