PCL2促進膠質(zhì)瘤血管生成的機制研究①

常 越 田金成 趙 茜 周亞南 英葉霞 呂 葉 曹相玫

（寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系，銀川 750004）

聚梳組蛋白（polycomb group，PcG）是重要的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄阻遏物，既往研究表明，PcG 蛋白組裝成2 個抑制性蛋白復合物，即多疏阻遏復合物1（PRC1）和多疏阻遏復合物2（PRC2），兩者協(xié)同調(diào)控組蛋白修飾及染色質(zhì)狀態(tài)沉默基因表達［1］。多梳樣蛋白2（polycomb-like protein 2，PCL2）是構成PRC2復合物的重要輔助因子，能夠調(diào)節(jié)PRC2 酶活性及PRC2基因合成等，影響多能基因表達程序穩(wěn)定性，在細胞命運控制中起重要作用［2-3］。近年研究報道，過表達PCL2 能夠增加白血病細胞的化療敏感性，有效降低異種移植小鼠模型急性髓細胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）復發(fā)率［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PCL2 表達增加與膠質(zhì)瘤增殖關系密切［5］。因此，本研究將繼續(xù)研究PCL2 與膠質(zhì)瘤血管形成的關系，旨在明確其對膠質(zhì)瘤血管異常增生的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人惡性膠質(zhì)母細胞瘤來源細胞系U87-MG由本實驗室保存；PCL2、核因子E2 相關因子2（nu‐clear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）購自英國Abcam公司；zeste基因增強子同源物2（enhancer ofzesteho‐molog 2，EZH2）、β-actin、GAPDH、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology 公司；EDTA 抗原修復液、山羊血清、DAB 試劑、蘇木素購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清、胰蛋白酶、0.25%EDTA、牛血清白蛋白、BSA 購自美國Invitrogen 公司；0.45μm PVDF 膜、ECL 發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析 本研究中所有腫瘤PCL2 表達數(shù)據(jù)源自在線分析軟件GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）。GEPIA（基因表達譜交互式分析）是基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫腫瘤和正常樣本進行基因表達分析的資源，采用生物信息學工具CIBERSORT、EPIC 和quantTIseq 對TCGA/GTEx數(shù)據(jù)庫中各樣本進行分析，由北京大學的TANG等［6］共同開發(fā)。

1.2.2 免疫組織化學染色 膠質(zhì)瘤石蠟組織標本源自2013 年至2015 年寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科手術切除的膠質(zhì)瘤患者，共73例，男38例，女35例，所有標本均經(jīng)過病理證實，病例資料完整。由兩位資深病理醫(yī)師復驗后確診，WHOⅠ級3 例，Ⅱ級25 例，Ⅱ~Ⅲ級1 例，Ⅲ級18 例，Ⅲ~Ⅳ級24 例，Ⅳ級2例。將腫瘤與正常腦組織標本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張（4μm），進行抗原修復，65 ℃烘片，3%H2O2阻斷8 min，檸檬酸高壓抗原修復10 min，10%山羊血清封閉20 min，添加一抗工作液（PCL2 1∶100 稀釋）37 ℃孵育1 h，添加二抗工作液（山羊抗小鼠IgG）37 ℃孵育60 min，顯微鏡觀察DAB 染色時間，蘇木素復染1 min 使核著色，清水洗掉多余染色劑，乙醇脫水，中性樹脂封片，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析數(shù)據(jù)。染色結果由染色強度百分比（棕黃色顆粒表示陽性結果）和染色細胞百分比（細胞質(zhì)或細胞核中棕黃色顆粒表示陽性結果）確定。

1.2.3 U87 細胞處理 將U87 細胞接種于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，2×105個/100 cm2培養(yǎng)，5%CO2、37 ℃孵育8 h，貼壁后進行慢病毒感染，感染滴度設置為MOI=20∶1、50∶1、100∶1，無血清MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞72 h，熒光顯微鏡觀察細胞感染效率。

1.2.4 Western blot 收集1.2.3 中各組細胞并提取全蛋白，BCA 蛋白含量檢測試劑盒定量，加入上樣緩沖液（40 μg/孔）95 ℃熱變性5 min，10%SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉1 h，加入3%BSA 稀釋的一抗（PCL2 1∶200、Nrf2 1∶500、HO-1 1∶500、EZH2 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）、HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育60 min，以β-actin 為內(nèi)參。ECL 化學發(fā)光試劑（A∶B=1∶1）顯色1 min，曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，目標蛋白表達=目標蛋白灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，各實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 PCL2 在多種腫瘤組織中呈異常表達 TCGA數(shù)據(jù)庫分析腫瘤中PCL2基因表達，PCL2在AML、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）、腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe，KICH）等腫瘤組織中表達低于正常組織。相反，PCL2在低級別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）、膠質(zhì)母細胞瘤（glio‐blastoma，GBM）、彌漫性大B 細胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食道癌（esophageal carcinoma，ESCA）等腫瘤組織中表達高于癌旁組織（圖1）。

圖1 PCL2在多種腫瘤中的表達Fig.1 Expression of PCL2 in many kinds of tumors

2.2 PCL2 在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，與腫瘤厚壁血管形成相關 免疫組化觀察73 例膠質(zhì)瘤組織中PCL2 表達和分布情況，PCL2 蛋白表達陽性信號呈棕黃色，主要位于腫瘤細胞核內(nèi)，部分樣本中PCL2也在細胞質(zhì)中表達（圖2）。PCL2 蛋白在有厚壁血管增生的膠質(zhì)瘤組織中表達較高，提示PCL2 表達增加與膠質(zhì)瘤形成腎小球樣厚壁血管相關（χ2=13.909，P<0.01，表1）。

圖2 膠質(zhì)瘤細胞中PCL2 表達及表達部位（根據(jù)WHO 2016分級標準）Fig.2 Expression of PCL2 in glioma cells and its expres?sion sites（according to WHO 2016 grading stan?dard）

表1 PCL2表達與厚壁血管形成相關［例（%）］Tab.1 PCL2 expression is associated with thick-walled vessel formation［n（%）］

2.3 過表達PCL2 蛋白水平測定 Western blot 檢測hPCL2蛋白表達，腺病毒載體梯度MOI=20∶1、50∶1、100∶1 時感染U87-MG 細胞，結果顯示，空白對照組PCL2 蛋白表達較低，hPCL2 組蛋白表達明顯升高，hPCL2與空白對照組間及hPCL2組內(nèi)差異均有統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 重組腺病毒內(nèi)PCL2表達測定Fig.3 Determination of PCL2 protein level in recombi?nant adenovirus

2.4 hPCL2 上調(diào)EZH2 表達，并促進促血管生成因子合成 檢測血管形成的正調(diào)控基因Nrf2 和HO-1蛋白含量（PCL2 MOI=20∶1、50∶1、100∶1），hPCL2 組Nrf2 和HO-1 明顯高于對照組及空載體組，且在MOI=50 時表達最為顯著（圖4）。提示高表達PCL2可增加HO-1 和Nrf2 表達，同時促進EZH2 表達（PRC2復合物核心組分）。

圖4 過表達PCL2促進血管生成因子合成Fig.4 Overexpression of PCL2 promotes angiogenic factor synthesis

3 討論

膠質(zhì)瘤占成人原發(fā)性腦腫瘤的70%，具有浸潤性、易復發(fā)等特點，且預后不良［7］。在新生微血管延伸的引導下，膠質(zhì)瘤細胞遷移至大腦不同區(qū)域，并進一步發(fā)展。新血管形成一般包括血管發(fā)生和血管生成兩個過程［8］。血管發(fā)生指來自中胚層的纖維母細胞分化為內(nèi)皮細胞，并在無血管組織中增生形成原始血管網(wǎng)［9］。血管生成包括血管內(nèi)皮細胞活化、增生與遷移、細胞外基質(zhì)和基底膜降解、管腔樣結構形成與融合及細胞外基質(zhì)重建等多個步驟［10］。

病理狀態(tài)下產(chǎn)生的大量調(diào)控因子能夠激發(fā)異常血管生成，這些調(diào)控因子包括血管生成因子、細胞因子、蛋白酶、粘連分子、血管生成相關基因、DNA 和組蛋白修飾及ncRNA 表達等［11］。病理性血管生成主要原因為促血管生成因子（如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β 等）和抑血管生成因子（如血管抑素、內(nèi)皮抑素）相互調(diào)節(jié)，當其平衡被破壞，即生成病理性血管，相應因子合成增加并與靶細胞（血管內(nèi)皮細胞）相應受體結合，經(jīng)過多個步驟，最終在腫瘤內(nèi)形成新生血管［12］。表觀遺傳學參與血管形成基因表達調(diào)控和生長因子介導的血管生成過程［13］。

Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過誘導抗氧化防御的多種基因表達在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用［14-15］。病理性血管形成與Nrf2 活化有關。KIM 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，敲低Nrf2 可阻斷結腸癌中氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）依賴性血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達并抑制腫瘤生長，同時能減少小鼠異種移植模型中依賴VEGF 血管生成。膀胱癌患者清中Nrf2、HO-1 含量較高者VEGF 也呈高表達［17］。表明高表達的Nrf2 使VEGF表達升高，并最終促進腫瘤血管生成。

HO 是血紅素分解過程中的起始酶和限速酶，HO-1被認為是Nrf2依賴性細胞應答的主要效應物，其代謝產(chǎn)物具有促進血管生長因子合成、內(nèi)皮細胞增殖及遷移、減少血管抑制因子合成和抑制內(nèi)皮細胞凋亡的作用［18-20］。CO 是HO-1 的代謝產(chǎn)物，通過刺激血管形成并誘導血管生成相關因子VEGF 與基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal derived factor-1，SDF-1）表達促進血管生成［21］。

表觀遺傳的各種機制共同參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展，且與膠質(zhì)瘤增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程密切相關［22］。表觀遺傳學機制包括DNA 甲基化異常、組蛋白修飾（乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等翻譯后修飾）、非編碼RNA、染色質(zhì)修飾等均與腫瘤發(fā)生有關［23］。PCLs 是重要的表觀遺傳因子，過表達PCL2能夠促進腫瘤細胞增殖并延緩細胞衰老［24］。

EZH2 是PRC2 的催化亞基，是一種特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過三甲基化修飾靶基因，抑制或沉默靶基因［25］。而EZH2 參與腫瘤血管形成，主要通過VEGF-E2、F-EZH2-VASH1 和FGF-2-NDY1/EZH2-miR-101 EZH2發(fā)揮作用［26-27］。HIF-1α與EZH2表達呈正相關，這兩種蛋白借助miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中取得聯(lián)系［28］。腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境使其HIF 表達異常增加，并最終導致EZH2 高表達，增強腫瘤血管形成能力。研究表明，EZH2 是卵巢癌和其他癌癥中腫瘤血管生成的關鍵調(diào)節(jié)因子，VEGF通過上調(diào)EZH2表達抑制血管抑制蛋白1（vasohibin 1，VASH1）表達，從而促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及血管生成［29］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達的PCL2 能夠上調(diào)EZH2表達，同時促進H3K27三甲基化及H3K4二甲基化，下調(diào)H3K9 二甲基化促進膠質(zhì)瘤細胞增殖。本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，PCL2 在多種腫瘤中呈異常表達，包括DLBC、ESCA、HNSC、膠質(zhì)瘤和LGG 等腫瘤組織；免疫組化分析顯示，PCL2 在膠質(zhì)瘤組織中呈較高表達，且在有厚壁血管形成的膠質(zhì)瘤中表達較高。

多項研究表明，在多種惡性腫瘤中，VEGF 和HIF-1α 可促進EZH2 表達。本研究表明，過表達PCL2基因能夠促進EZH2 表達，使Nrf2 和HO-1 表達升高，推斷其可能通過上調(diào)促血管生成因子（VEGF、HIF-1α 等）間接或直接進行血管形成正向調(diào)控。由此認為PCL2 在膠質(zhì)瘤血管形成過程中發(fā)揮重要作用。