Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠肝臟Cx43蛋白表達(dá)及肝纖維化的影響

陸宣兆，柴曉明，任朝興，朱志銘，李佳琪，黃鷺銘，莫廷美，馬 博

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

Ⅱ型糖尿病是由胰島素抵抗，伴隨胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能性損傷，繼而導(dǎo)致胰島素分泌不足，以血糖升高為主要特征的代謝疾病[1-2]。長(zhǎng)期高血糖易誘發(fā)多種并發(fā)癥，包括：糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變、男性生殖系統(tǒng)損傷、心血管及神經(jīng)病變等[3]。肝臟作為胰島素主要的靶器官，也是人體內(nèi)源性和外源性物質(zhì)主要的代謝場(chǎng)所，糖尿病對(duì)肝臟的損害也備受科學(xué)界的關(guān)注。Tilg等[4]研究表明：胰島素抵抗和糖尿病已經(jīng)成為誘發(fā)非酒精性脂肪肝的主要因素。長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)可進(jìn)一步導(dǎo)致不可逆的肝纖維化，并會(huì)增加糖尿病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。

肝臟纖維化是纖維結(jié)締組織異常增生的病理表現(xiàn)，是長(zhǎng)期的高血糖對(duì)肝臟持續(xù)性損傷的結(jié)果。但目前就糖尿病如何導(dǎo)致肝臟的纖維化的病理機(jī)制尚未完全明確?？p隙連接蛋白43(Cx43)作為體內(nèi)分布最為廣泛的連接蛋白家族成員，除了主要在細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮作用外，還參與了基因轉(zhuǎn)錄、代謝、自噬和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動(dòng)[7]。Cx43參與組織纖維化過程，并在眾多疾病模型中產(chǎn)生不同的影響。據(jù)Patin等[8]報(bào)道：上調(diào)Cx43可以激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路，從而發(fā)揮自身抗氧化作用，減輕糖尿病腎臟纖維化的發(fā)展。給予基因缺陷小鼠Cx43激活劑Gap-163后發(fā)現(xiàn)：上調(diào)小鼠心臟Cx43和磷酸化Cx43的表達(dá)，可以減慢心肌纖維化進(jìn)程[9]。然而，Li等[10]研究表明：在小鼠疤痕模型中，Cx43的上調(diào)可以促進(jìn)Ⅲ型膠原的積累。Price等[11]研究發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)的Cx43通過增加三磷酸腺苷的外排，可以促進(jìn)腎小管纖維化的發(fā)生。同時(shí)，Cx43對(duì)維持肝臟功能具有重要作用。與野生型小鼠相比，Cx43基因缺陷型小鼠對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷表現(xiàn)更為嚴(yán)重[12]。迄今為止，Cx43在Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟中的表達(dá)變化及其可能作用機(jī)制的研究尚未有所報(bào)道。因此，筆者通過構(gòu)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型，觀察Cx43在糖尿病小鼠肝臟中的表達(dá)變化并探討其可能的作用機(jī)制，以期為Ⅱ型糖尿病誘發(fā)的肝纖維化的預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)，純度98%，上海市麥克林生化科技有限公司；高脂飼料，南京市盛民科研動(dòng)物繁殖場(chǎng)；糖化血清蛋白(GSP)測(cè)定試劑盒、葡萄糖測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，南京市建成生物工程研究所有限公司；免疫組化試劑盒，武漢市博士德生物工程有限公司；Cx43抗體及其二抗，美國(guó)CST公司；α-SMA、E-cadherin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體及其二抗，武漢市三鷹生物技術(shù)有限公司；動(dòng)物RNA抽提試劑盒、cDNA第一鏈合成預(yù)混液，南通市碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)專用預(yù)混液，南京市諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡雄性ICR小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007，南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立與分組

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取8只小鼠作為正常組，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程給予小鼠以普通飼料喂養(yǎng)；另隨機(jī)選取8只小鼠作為Ⅱ型糖尿病模型組，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)給予高脂飼料喂養(yǎng)。并于喂養(yǎng)4周后，模型組小鼠禁食12 h，腹腔注射STZ(溶劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，劑量為30 mg/kg，臨用前配制)，連續(xù)5 d。正常組小鼠則腹腔注射給予同體積的STZ。7 d后，測(cè)定模型組小鼠空腹血糖(FBG)，發(fā)現(xiàn)FBG>11.1 mmol/L，即被視為Ⅱ型糖尿病小鼠模型。模型組小鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周后，檢測(cè)肝臟組織和血清生化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立Fig.1 The establishment of type Ⅱ diabetes model

1.2.2 血糖和糖化血清蛋白的測(cè)定

血樣以3 500 r/min離心15 min，留取血清，血糖檢測(cè)采用葡萄糖氧化酶法，糖化血清蛋白采用果糖胺法，分別依照1.1.1項(xiàng)中的試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 肝臟形態(tài)和肝臟指數(shù)

取肝臟置于生理鹽水中漂洗，濾紙吸去肝臟表面液體，隨后拍攝肝臟圖片，同時(shí)稱取肝臟濕質(zhì)量，按式(1)計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)

(1)

1.2.4 血清ALT、AST和AKP含量的測(cè)定

采用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定血清AST、ALT濃度，采用磷酸苯二鈉底物法測(cè)定血清AKP濃度。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察

摘取的肝臟組織置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，依次脫水，石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片，烤片處理。經(jīng)二甲苯、梯度乙醇水化，蒸餾水洗 5 min后，參照文獻(xiàn)[13]的方法，進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色，隨后進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透片，干燥，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)的改變。參照文獻(xiàn)[14]的方法，取各組小鼠肝臟制作冰凍切片，進(jìn)行肝組織油紅O染色，甘油明膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)分布情況。

1.2.6 免疫組化

肝組織石蠟切片經(jīng)60 ℃烘片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；H2O2去除內(nèi)源性過氧化氫酶；0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液微波爐中高火抗原修復(fù)3次，每次8 min；體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉；滴加一抗α-SMA(按體積比1∶200稀釋)和一抗E-cadherin(按體積比1∶400稀釋)，一抗Cx43(按體積比1∶100稀釋)孵育，4 ℃過夜；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗3次后，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次后，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，37 ℃孵育1 h；隨后采用氧化二氨基聯(lián)苯胺顯色并用蘇木素復(fù)染3 min，經(jīng)HCl、乙醇快速分化液分化，流動(dòng)自來水下反藍(lán)；最后采用中性樹膠封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 蛋白免疫印跡測(cè)定組織中蛋白的表達(dá)

稱取一定質(zhì)量的肝臟組織，預(yù)冷PBS清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液勻漿，隨后于恒溫振蕩器上0 ℃振蕩裂解30 min，留取上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，余下上清液加入上樣緩沖液100 ℃水浴6 min；體積分?jǐn)?shù)10%SDS-PAGE凝膠電泳，以濕轉(zhuǎn)法(100 V、120 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉120 min，孵育一抗Cx43(按體積比1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，室溫120 min孵育對(duì)應(yīng)二抗；采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯影，使用凝膠成成像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號(hào)，曝光后使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 qPCR

采用離心柱法的動(dòng)物RNA抽提試劑盒提取肝組織總RNA；依照cDNA第一鏈合成預(yù)混液說明書配制20 μL體系，按照42 ℃、10 min，80 ℃、10 min程序合成cDNA。依照qPCR預(yù)混液說明書，配制20 μL qPCR體系。Cx43和GAPDH引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司，引物設(shè)計(jì)序列為Cx43 primer[正向引物：5-G￣G￣T￣C￣T￣G￣A￣G￣A￣G￣C￣C￣C￣G￣A￣A￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣T-3，反向引物：5-C￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣C￣T￣G￣G￣G￣C￣A￣C￣C￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣T-3]；GAPDH primer[正向引物：5-AATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3，反向引物：5-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3]。采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法，按照95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)融解曲線反映擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量作為參照，分析目標(biāo)基因的表達(dá)量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8.0比較2組數(shù)據(jù)差異顯著性；t檢驗(yàn)法，以P<0.05作為差異顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ⅱ型糖尿病小鼠動(dòng)物模型的建立

參照文獻(xiàn)[15]的方法，通過高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合STZ注射的方法，成功建立了Ⅱ型糖尿病小鼠的模型。高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)外周胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，低劑量的STZ造成了胰島β細(xì)胞輕度損傷，可以較好模擬人類Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和代謝特征，并且參照文獻(xiàn)[16]的方法實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：高血糖狀態(tài)可以在一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。

Ⅱ型糖尿病模型建立8周后，分別檢測(cè)小鼠空腹血糖和糖化血清蛋白指標(biāo)，以糖化血清蛋白反映小鼠近8周的平均血糖水平，結(jié)果見圖2。由圖2可知：與正常組相比，模型組小鼠空腹血糖、糖化血清蛋白含量均顯著增加。說明Ⅱ型糖尿病模型組小鼠在8周的觀察期間內(nèi)，機(jī)體均維持在高血糖狀態(tài)，血糖調(diào)節(jié)能力下降，糖代謝異常。

2.2 Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的小鼠肝損傷

取出小鼠肝臟后拍照留存，并觀察肝臟形態(tài)變化，結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知：正常組肝臟質(zhì)地柔軟，呈紅褐色，色澤均一。與正常組相比，模型組肝臟體積增大，質(zhì)地稍硬，色澤呈現(xiàn)黃白色與紅褐色相間，提示肝臟可能發(fā)生損傷并存在脂肪沉積的現(xiàn)象。同時(shí)，稱取小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量后，計(jì)算肝臟指數(shù)，結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知：模型組肝臟指數(shù)相對(duì)于正常組顯著增加，表明Ⅱ型糖尿病的小鼠肝臟發(fā)生了病理性腫大。

***表示與正常組相比P<0.001圖2 小鼠空腹血糖和糖化血清蛋白的變化情況Fig.2 The level of fasting blood glucose and glycated serum proteins in mice

圖3 Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠肝臟形態(tài)和肝臟指數(shù)的影響Fig.3 Effects of type Ⅱ diabetes on liver morphology and liver index in mice

肝臟組織中轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT和AKP含量豐富，當(dāng)肝細(xì)胞損害發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶流入血液，血清中AST和ALT含量上升。血清AKP水平的升高提示肝臟疾病的發(fā)生。圖4為Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠血清AST、AKP和ALT含量的影響。由圖4可知：相較于正常組，模型組小鼠肝臟指數(shù)和血清AST、AKP和ALT均呈顯著性增加，提示模型組小鼠的肝功能已受損。

通過對(duì)肝組織的HE染色，觀察Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知：正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索呈放射狀規(guī)則排列，肝血竇大小正常，肝細(xì)胞核無空泡變性，形狀規(guī)則。模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索排列紊亂，肝血竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞呈現(xiàn)空泡樣改變，細(xì)胞核大小不規(guī)則，染色質(zhì)固縮。Saponaro等[17]研究表明：胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝臟的異位沉積。油紅O染色觀察脂質(zhì)在肝臟中的沉積情況，紅色代表脂質(zhì)液滴在肝組織中的分布。由圖5還可知：相較于正常組，模型組脂質(zhì)液滴在肝組織的分布明顯增加，表明Ⅱ型糖尿病的小鼠肝臟發(fā)生了明顯的脂肪沉積現(xiàn)象，模型組小鼠肝損傷并伴有脂肪沉積現(xiàn)象。

**表示與正常組相比P<0.01圖4 Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠血清AST、AKP和ALT含量的影響Fig.4 Effects of type Ⅱ diabetes on serum AST,AKP and ALT levels in mice

圖5 Ⅱ型糖尿病誘發(fā)的小鼠肝損傷和脂肪沉積Fig.5 Type Ⅱ diabetes induced liver injury and fat deposition in mice

2.3 Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化

Masson染色觀察肝組織的纖維化程度，藍(lán)色區(qū)域?yàn)槟z原纖維區(qū)域，結(jié)果見圖6(a)。由圖6(a)可知：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈呈現(xiàn)少量膠原纖維沉積；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)空泡樣變化，膠原纖維分布明顯增加。α-SMA和E-cadherin的免疫組化結(jié)果見圖6(b)。由圖6(b)可知：模型組相較于正常組肝組織中α-SMA棕黃色的陽性表達(dá)明顯增加，并且在匯管區(qū)域呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，而模型組E-cadherin的棕黃色陽性表達(dá)明顯減少。在肝纖維化發(fā)展過程中，肝星狀細(xì)胞激活并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，膠原纖維表達(dá)增加，并啟動(dòng)α-SMA的表達(dá)， E-cadherin表達(dá)減少，隨后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的發(fā)生，這與Nanthakumar等[18]和Hintermann等[19]的研究結(jié)果一致。

圖6 Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化Fig.6 Type Ⅱ diabetes induces liver fibrosis in mice

2.4 Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠肝臟Cx43表達(dá)的影響

小鼠肝組織Cx43mRNA表達(dá)結(jié)果見圖7(a)，由圖7(a)可知：模型組Cx43mRNA表達(dá)顯著高于正常組。小鼠肝組織Cx43的蛋白免疫印跡和免疫組化結(jié)果分別見圖7(b)和7(c)。由圖7(b)和7(c)可知：相較于正常組，模型組小鼠肝組織中Cx43蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這與qPCR的結(jié)果相一致。以上結(jié)果共同表明：Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)的小鼠肝臟Cx43表達(dá)增加。Maes等[20]的研究表明：在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷模型中，肝臟Cx43表達(dá)上調(diào)。同樣，Balasubramaniyan等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)：肝硬化模型中肝組織Cx43的表達(dá)增加。Cogliati等[22]的研究也顯示：在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，Cx43基因缺陷小鼠相較于野生型小鼠，肝臟中Cx43表達(dá)增加，肝纖維化程度表現(xiàn)更為嚴(yán)重。以上研究均表明：Cx43的過表達(dá)可能與肝臟損害有關(guān)。

圖7 Ⅱ型糖尿病對(duì)小鼠肝組織Cx43表達(dá)的影響Fig.7 Effects of type Ⅱ diabetes on hepatic Cx43 expression in mice

Cx43家族是主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間通訊功能的連接通道。Cooreman等[23]研究也表明：Cx43作為該蛋白家族成員，主要在肝組織的非實(shí)質(zhì)性肝細(xì)胞，包括肝星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)。肝星狀細(xì)胞的激活在肝纖維化的過程中發(fā)揮著重要作用。激活的肝星狀細(xì)胞表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而增加膠原纖維的合成[24]。Fischer等[25]研究顯示：體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中活化的肝星狀細(xì)胞中都觀察到Cx43的表達(dá)增加。另有Wu等[26]研究表明：Cx43通過激活TGF-β信號(hào)通路，誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，增加皮膚α-SMA和纖連蛋白FN表達(dá)，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。以上研究均表明了Cx43/TGF-β信號(hào)通路的激活可能具有誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞激活的潛力。除此之外，Li等[10]的研究表明：上調(diào)的Cx43通過調(diào)節(jié)Erk/MMP-1/collagen-Ⅲ通路，促進(jìn)Ⅲ型膠原積累，提示過表達(dá)的Cx43可能與膠原纖維的合成增加有關(guān)。由此可見，Cx43的表達(dá)上調(diào)后，可能通過激活肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并導(dǎo)致肝臟膠原纖維的合成增加。

3 結(jié)論

Ⅱ型糖尿病誘導(dǎo)了小鼠肝損傷和肝纖維化的發(fā)生。筆者發(fā)現(xiàn)了Cx43在Ⅱ型糖尿病小鼠肝組織中表達(dá)的增加，并且發(fā)現(xiàn)： Cx43的表達(dá)上調(diào)可能通過參與激活肝星狀細(xì)胞，增加膠原纖維合成，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟纖維化的發(fā)生。

綜上所述，本研究為預(yù)防和治療糖尿病誘發(fā)的肝損傷和肝纖維化提供了理論基礎(chǔ)，下一步可以通過干擾Cx43的表達(dá)，觀察Cx43對(duì)肝星狀細(xì)胞的影響，并進(jìn)一步明確在糖尿病誘發(fā)的肝損傷和肝纖維化中調(diào)控Cx43過表達(dá)及其所導(dǎo)致肝纖維化的分子機(jī)制。