新型冠狀病毒快速檢測研究進(jìn)展

王炳熙，趙浩東，陳金龍

(中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在2019年12月開始在全球爆發(fā)并迅速蔓延，2020年3月11日世界衛(wèi)生組織(WTO)正式宣布COVID-19疫情已構(gòu)成全球大流行[1]。截至2021年1月12日，中國確診患者已累計(jì)9萬余例，全球確診已超過8 900萬例，死亡人數(shù)接近200萬，疫情已影響全球220多個(gè)國家和地區(qū)[1]，對(duì)全人類的生命健康造成了極大威脅。

SARS-CoV-2與重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)同屬β冠狀病毒，但SARS-CoV-2更具傳染性[2]。SARS-CoV-2在氣溶膠、冷凍食物表面仍可存活數(shù)小時(shí)至數(shù)天，因此，可通過呼吸道飛沫、氣溶膠、直接或間接接觸、糞口傳播或者冷鏈運(yùn)輸?shù)韧緩剑瑢?shí)現(xiàn)物傳人、動(dòng)物傳人和人傳人，繼而在全球范圍內(nèi)廣泛傳播[3-7]。Guan等[8]研究指出：COVID-19的潛伏期一般為1～14 d，中位潛伏期為3 d，極少數(shù)患者的潛伏期最長可達(dá)24 d。處于潛伏期的患者通常沒有明顯的癥狀，但已具備傳染性。COVID-19患者的臨床癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽、乏力、肌痛、腹瀉及并發(fā)多器官衰竭[9-12]。目前，尚無特效藥可用于治療COVID-19，瑞德西韋、氯喹、羥氯喹、利托那韋/洛匹那韋和干擾素-β等西藥已被證實(shí)對(duì)SARS-CoV-2感染具有一定的療效[13-14]；中醫(yī)藥是我國特有的衛(wèi)生資源，對(duì)COVID-19患者進(jìn)行早期干預(yù)，可有效緩解病情的發(fā)展，中西醫(yī)結(jié)合治療則可達(dá)到相輔相成、雙管齊下的效果[15]。顯然，阻斷COVID-19最有潛力的方法是開發(fā)疫苗，目前中國的新冠疫苗已上市，并在國內(nèi)外被推廣使用，其安全性和有效性日益得到多國衛(wèi)生部門和專業(yè)人士的認(rèn)可[16]。此外，值得強(qiáng)調(diào)的是，開發(fā)準(zhǔn)確、快速的COVID-19檢測手段在整個(gè)疫情防控過程中同樣具有重要意義，不僅有利于早發(fā)現(xiàn)、早隔離潛在的COVID-19患者，也可用于預(yù)后效果的評(píng)估。筆者簡要介紹SARS-CoV-2的病原學(xué)特征，并回顧國內(nèi)外對(duì)COVID-19檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用進(jìn)展，以期為COVID-19的早期確診與防控提供幫助。

1 SARS-CoV-2的病原學(xué)特征

SARS-CoV-2是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，每個(gè)SARS-CoV-2粒子直徑為60～140 nm，與分別在2002和2012年引起流行病的SARS-CoV和MERS-CoV同屬β冠狀病毒[2，17]。復(fù)旦大學(xué)張永振教授及其團(tuán)隊(duì)在疫情初期，利用基因測序技術(shù)確定了SARS-CoV-2的基因組序列，全長為29 903 bp(GenBank序列號(hào)為MN908947)[18]。經(jīng)基因比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：SARS-CoV-2與SARS-CoV相似度高達(dá)79.6%，與MERS-CoV的相似度僅有40%，重要的是，SARS-CoV-2與一種寄生于蝙蝠中的冠狀病毒的序列一致性高達(dá)96%[19-20]。

與其他冠狀病毒相似，SARS-CoV-2主要包括4種結(jié)構(gòu)蛋白，即：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)[21]，詳見圖1。S蛋白與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)結(jié)合，以促進(jìn)膜的融合，其他3種蛋白則在病毒的組裝過程中起著關(guān)鍵作用[22]。ACE2在肺部、心臟、腎臟、睪丸、肝臟和腦等器官中分布廣泛，其中，肺部是病毒主要的靶器官，因此，COVID-19患者常表現(xiàn)出一些與肺部感染相關(guān)的常見癥狀，例如：發(fā)燒、咳嗽、咳痰、疲勞、呼吸急促、喉嚨疼痛或頭痛。在嚴(yán)重情況下，還會(huì)引發(fā)肺炎、嚴(yán)重的急性呼吸道綜合征、腎衰竭和死亡[9-12]。雖然SARS-CoV-2的致死率不及SARS-CoV，但其對(duì)ACE2的結(jié)合親和力明顯強(qiáng)于SARS-CoV[23]，因此，SARS-CoV-2具有更強(qiáng)的傳播性。除了可以根據(jù)胸部CT和病毒分離培養(yǎng)的手段確診COVID-19外，病毒RNA和蛋白質(zhì)(如S蛋白、N蛋白等)亦可作為對(duì)COVID-19檢測的靶標(biāo)[9]。此外，也可以通過患者免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的IgM、IgG等抗體來了解患者的感染史[9]。截至2021年1月12日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)用于檢測SARS-CoV-2的試劑共54個(gè)(表1)，主要涉及核酸檢測、抗體檢測和抗原檢測。此外，國內(nèi)外研究人員為了能更便捷、快速檢測SARS-CoV-2，已開發(fā)出多種新型生物傳感器，但目前這些技術(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，還未能得到廣泛使用。

圖1 SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)以及COVID-19檢測的潛在相關(guān)靶向位點(diǎn)[21]Fig.1 The structure of SARS-CoV-2 and related targeting sites that can be used for the COVID-19 detection[21]

表1 國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的SARS-CoV-2檢測試劑注冊(cè)信息

2 分子生物學(xué)檢測

2.1 核酸檢測

SARS-CoV-2的RNA在患者出現(xiàn)癥狀前的2～3 d即可被檢測到，且根據(jù)患者感染的嚴(yán)重程度，可在發(fā)病后仍存留25～50 d[24]。因此，以核酸為基礎(chǔ)的病毒檢測手段在疫情防控中發(fā)揮著重要作用，尤其是在無癥狀患者的確診和康復(fù)患者的出院評(píng)判方面。

2.1.1 熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)

目前qRT-PCR已逐漸成為診斷是否感染SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)[25]。qRT-PCR是一種基因擴(kuò)增技術(shù)，首先，將目標(biāo)RNA(在COVID-19檢測中為SARS-CoV-2 RNA)逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后設(shè)計(jì)引物和熒光猝滅探針進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而獲得有關(guān)SARS-CoV-2存在的定量結(jié)果[26-27]。該方法具有可靠性好、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高以及能有效解決PCR產(chǎn)物污染問題等特點(diǎn)。目前，由不同制造商開發(fā)的17種基于qRT-PCR的COVID-19試劑盒已獲得國家藥監(jiān)局的批準(zhǔn)，檢測靶標(biāo)涉及ORF1ab、N、E和S等基因[28-29]。Haddar等[30]對(duì)用于SARS-CoV-2 RNA檢測的幾種商業(yè)qRT-PCR試劑盒的分析性能進(jìn)行了評(píng)估。研究結(jié)果表明：雖然循環(huán)數(shù)閾(Ct)的差異比較分散，但試劑盒之間的結(jié)果相似，符合率達(dá)到95%以上，可以滿足臨床對(duì)SARS-CoV-2的常規(guī)診斷。

然而，基于qRT-PCR的檢測方法同樣面臨著一些困難，例如：耗時(shí)費(fèi)力的擴(kuò)增過程、需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備以及需要專業(yè)的技術(shù)人員在特定的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行操作，這些都限制了該方法在現(xiàn)場篩查和低資源地區(qū)的使用[31]。此外，由于SARS-CoV-2 RNA容易變異以及樣本采集、保存和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩氐母蓴_，qRT-PCR的檢測可能存在較高的假陰性率，檢出率僅為30%～50%[32]。因此往往需要重新采集患者的樣本，更換采樣部位或者收集多個(gè)部位的樣本進(jìn)行混樣檢測或同時(shí)檢測，從而避免假陰性檢測結(jié)果的干擾。

2.1.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一類在恒溫條件下的核酸擴(kuò)增技術(shù)，能有效克服反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)所需要的復(fù)雜熱循環(huán)設(shè)備方面的不足。筆者主要介紹環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)、恒溫?cái)U(kuò)增芯片和基于CRISPR/Cas酶的檢測技術(shù)在COVID-19檢測中的應(yīng)用。目前，國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)了5個(gè)等溫?cái)U(kuò)增類SARS-CoV-2核酸檢測試劑。

2.1.2.1 LAMP

LAMP在2000年由Notomi[33]首次提出，是一種不依賴任何專門的儀器設(shè)備，即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測的技術(shù)，其檢測成本遠(yuǎn)低于qRT-PCR，可以在60～65 ℃、15～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的恒溫核酸擴(kuò)增。LAMP的最大亮點(diǎn)在于檢測結(jié)果的可視化。在DNA擴(kuò)增過程中，大量的焦磷酸從脫氧核糖核酸三磷酸(dNTPs)中被釋放出來，與反應(yīng)液中的Mg2+反應(yīng)，產(chǎn)生大量的白色焦磷酸鎂沉淀，其渾濁程度可作為檢測指標(biāo)，肉眼即能進(jìn)行判斷[34]。Tomita等[35]通過使用一種鈣黃綠素?zé)晒鈴?fù)合物，在焦磷酸鎂存在的情況下，發(fā)出明亮熒光來改善終點(diǎn)檢測的效果。此外，擴(kuò)增過程中溶液的pH也發(fā)生了明顯變化，因此，也可通過對(duì)pH敏感的染料進(jìn)行可視化檢測[36]。通過對(duì)76例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)測試，以評(píng)估其臨床效果，結(jié)果表明：該方法的靈敏度與qRT-PCR相當(dāng)，特異性為97.6%[37]。但開發(fā)RT-LAMP技術(shù)的挑戰(zhàn)在于反應(yīng)條件(如：時(shí)間、溫度等)的優(yōu)化和引物的設(shè)計(jì)，由于存在病毒引物結(jié)合區(qū)突變的影響，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需注意避開這些突變位點(diǎn)，以提高檢測率[29-38]。成都博奧晶芯生物科技有限公司聯(lián)合清華大學(xué)、四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院將LAMP與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)開發(fā)出了一款包括檢測SARS-CoV-2在內(nèi)的“6項(xiàng)呼吸道病毒核酸檢測試劑盒”，該試劑盒于2020年3月26日獲國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，可在1.5 h內(nèi)對(duì)SARS-CoV-2，A、B型流感以及現(xiàn)存的其他病毒進(jìn)行區(qū)分。最近，Lau等[39]在傳統(tǒng)的RT-LAMP 4個(gè)引物的基礎(chǔ)上，再加入2個(gè)群體引物，以提高反應(yīng)效率，以羥基萘酚藍(lán)(HNB)的顏色變化來檢測LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物，該設(shè)計(jì)將RT-LAMP的反應(yīng)時(shí)間縮短至24 min，檢出限僅為1個(gè)拷貝數(shù)(copy)，因此，該技術(shù)對(duì)低病毒載量感染的檢測具有重要意義。

2.1.2.2 RPA

RPA將重組蛋白與DNA聚合酶結(jié)合使用，在37～42 ℃恒溫范圍內(nèi)，能快速擴(kuò)增目標(biāo)DNA或RNA，所需時(shí)間少于30 min，且可支持對(duì)樣品進(jìn)行多重化的定量分析[40]。RPA試劑以凍干形式保存，便于貯藏和運(yùn)輸，檢測過程無需任何儀器，是一種非常有前途，可用于現(xiàn)場診斷的等溫核酸檢測方法。Amer等[41]已經(jīng)證明了RPA可被應(yīng)用于其他冠狀病毒的檢測，例如牛冠狀病毒(BCoV)。目前，已開發(fā)出不少基于逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫?cái)U(kuò)增(RT-RPA)的檢測手段，用于快速診斷是否感染SARS-CoV-2。例如Behrmann等[42]在exo探針設(shè)計(jì)原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，提出內(nèi)部猝滅(exo-IQ)探針原理，消除了exo探針只能用于序列之間2～5 nt內(nèi)且必須包含2個(gè)胸腺嘧啶的限制。所提出的RPA外顯子探針是長度至少為46 nt的寡核苷酸，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)由熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)組成，并由一個(gè)嘌呤/嘧啶(AP)位點(diǎn)隔開[42]。一旦探針與其靶序列雜交，核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的AP核酸內(nèi)切酶活性就會(huì)切割A(yù)P位點(diǎn)，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)在空間上的分離，使得熒光強(qiáng)度隨之增加，熒光強(qiáng)度增加的程度則與RPA產(chǎn)物的量直接相關(guān)[42]。該方法的運(yùn)行時(shí)間為15～20 min，對(duì)于高病毒濃度的RNA樣品，在7 min內(nèi)即可獲得結(jié)果，是迄今為止最快速的，基于核酸檢測的檢測COVID-19的方法之一[42]。

2.1.2.3 基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)系統(tǒng)的檢測技術(shù)

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因檢測技術(shù)是用于SARS-CoV-2 RNA檢測的，另一項(xiàng)先進(jìn)的分子診斷技術(shù)，較為經(jīng)典的是張鋒團(tuán)隊(duì)于2017年開發(fā)的，基于CRISPR/Cas13a與PRA擴(kuò)增耦聯(lián)的SHERLOCK技術(shù)[43]，該技術(shù)已被應(yīng)用于SARS-CoV-2的檢測[44]，其原理是：Cas13a在crRNA引導(dǎo)下，識(shí)別SARS-CoV-2的S基因和ORF1ab基因后，會(huì)被激活出附帶的、對(duì)非特異性dsRNA酶的切割活性，因此能夠切割RNA報(bào)告分子，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離，并釋放出熒光信號(hào)[43]。為了能更便捷、直觀讀取檢測結(jié)果，該團(tuán)隊(duì)將結(jié)果呈現(xiàn)形式改進(jìn)為試紙條式，檢測過程無需其他設(shè)備，1 h內(nèi)即可定性判斷是否感染病毒[43]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已對(duì)該技術(shù)頒布了緊急使用許可。

Chen等[45]研究發(fā)現(xiàn)：Cas12酶在crRNA的引導(dǎo)下，與目標(biāo)序列結(jié)合后，同樣可被激活出非特異性的切割活性，與Cas13不同的是，Cas12識(shí)別的是DNA而不是RNA，因此無需將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA，該技術(shù)被命名為DETECTR。Broughton等[46]重新配置了DETECTR平臺(tái)，使其適用于SARS-CoV-2的檢測，可在40 min內(nèi)得到檢測結(jié)果。該團(tuán)隊(duì)通過RT-LAMP擴(kuò)增病毒RNA，然后打開測試管加入CRISPR/Cas12試劑，最后通過將側(cè)流條插入試管中來讀取檢測結(jié)果。然而，將核酸擴(kuò)增和Cas檢測過程分開成2個(gè)獨(dú)立步驟的操作，不僅使測試過程復(fù)雜化，還會(huì)造成潛在的交叉污染，因此，Chen等[47]將Cas12酶預(yù)先置于測試管蓋的內(nèi)壁上，并加入礦物油覆蓋RT-LAMP試劑，以防止反應(yīng)溶液揮發(fā)或擴(kuò)增子擴(kuò)散，待擴(kuò)增結(jié)束后，通過搖晃的方式使Cas12酶與擴(kuò)增子反應(yīng)液充分混合，而不是重新打開測試管添加CRISPR/Cas酶試劑。Ding等[48]則進(jìn)一步提出了一種多合一雙重CRISPR-Cas12a(AIOD-CRISPR)的檢測技術(shù)，利用2個(gè)單獨(dú)的crRNA生成一對(duì)Cas12a-crRNA，該方法的亮點(diǎn)在于：將核酸擴(kuò)增和對(duì)Cas12a酶檢測的所需組分全部混合在同一個(gè)反應(yīng)器中，只需在單一溫度(37 ℃)中進(jìn)行孵育(圖2)。因此，一個(gè)低成本的暖手器也可被用作AIOD-CRISPR分析的孵化器，其檢測過程僅為20 min，可檢測低至5個(gè)copies的病毒N基因RNA[48]。

圖2 AIOD-CRISPR分析系統(tǒng)的工作示意[48]Fig.2 Schematic work of the AIOD-CRISPR assay system[48]

該方法已通過測試28個(gè)COVID-19臨床拭子樣本得到驗(yàn)證，與RT-PCR測定的結(jié)果相一致。目前，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)還處于新興階段，雖然已開發(fā)的方法無法實(shí)現(xiàn)定量分析，但其為開發(fā)低成本、快速準(zhǔn)確的即時(shí)診斷方法開辟了未來可能的途徑。

2.2 高通量測序(NGS)

NGS又名下一代測序，通過對(duì)疑似樣本中所有核酸或來自特定靶標(biāo)的核酸進(jìn)行測序和分析，從而獲得樣本中所有病原微生物或其靶標(biāo)序列[49]。利用該技術(shù)可在第一時(shí)間獲取未知病毒的基因組序列信息，有利于對(duì)病毒的鑒定、溯源和診斷，為突發(fā)疫情的防控和后續(xù)研究提供幫助。在本次疫情初期，除了復(fù)旦大學(xué)張永振教授聯(lián)合悉尼大學(xué)Edward Holmes教授對(duì)患者的支氣管肺泡灌洗液(肺分泌物)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了SARS-CoV-2的全基因組序列，并將該測序結(jié)果發(fā)布于病毒學(xué)網(wǎng)站(virological.org)，系全球最早公布該病毒序列的團(tuán)隊(duì)以外[18]；Zhou等[50]、Lu等[51]所在的研究團(tuán)隊(duì)也通過宏基因測序和納米孔靶向測序(NTS)等技術(shù)對(duì)SARS-CoV-2感染者的全長基因組進(jìn)行了分析。目前病例確診方式之一就是：“病毒基因測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源”[17]。NGS的優(yōu)勢在于高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性，但其檢測成本較高、檢測時(shí)間較長、需要專業(yè)人員對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行解讀，因而不能被廣泛應(yīng)用。針對(duì)RT-PCR核酸檢測的陰性結(jié)果，但臨床表型高度疑似的患者，可利用NGS進(jìn)一步確認(rèn)[52]。為了提高臨床實(shí)用性，武漢大學(xué)劉天罡教授等組建的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)開發(fā)出NTS測序平臺(tái)(MinLON)，是目前最小的便捷式測序儀[53]。MinlON可全面覆蓋病毒基因組上主要的基因區(qū)域，在6～10 h內(nèi)能同時(shí)檢測SARS-CoV-2在內(nèi)的多種常見呼吸道病毒，并監(jiān)測病毒的突變[53]。

3 免疫學(xué)檢測

3.1 抗體檢測

SARS-CoV-2侵入人體后，人體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行防御[54]。通常情況下，IgM抗體會(huì)在機(jī)體發(fā)生初次免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生，而多在癥狀發(fā)作后的3～5 d出現(xiàn)表征，并于2周左右達(dá)到峰值。IgM抗體維持時(shí)間短、濃度低并且親和力較低，當(dāng)其接近消失時(shí)，IgG的含量達(dá)到高峰。IgG產(chǎn)生時(shí)間晚，但維持時(shí)間長、濃度和親和力均顯著高于IgM[54-56]。目前將血清抗體的檢測作為確診SARS-CoV-2的依據(jù)之一，即將血清SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體呈陽性；血清SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)陽性；恢復(fù)期較急性期血清濃度升高至4倍以上作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[17]。目前，國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)了26個(gè)抗體檢測試劑盒，檢測目標(biāo)均為IgM/IgG，檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、膠體金免疫層析法(GIGA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CILA)等。

3.1.1 ELISA

ELISA是一種將抗原-抗體特異性反應(yīng)和酶對(duì)底物高效催化作用相結(jié)合的，高敏感性免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[57]。原理是將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，與加入的受檢樣品中的抗原或抗體形成特異性的抗原-抗體復(fù)合物，再與之后加入的被酶標(biāo)記過的抗原或抗體在固相載體上形成三元復(fù)合物，最后加入酶，反應(yīng)底物繼而發(fā)生顯色[58]。利用病毒重組S蛋白、Rp3 N蛋白等作為ELISA包被抗原的方法已被證明具有良好的準(zhǔn)確性和選擇性[59-60]。通常情況下，ELISA需要通過比色法或分光光度計(jì)來進(jìn)行定性或半定量分析，存在過程繁瑣、檢測速度慢等方面的不足。近期，Kasetsirikul等[61]提出了一種簡單且廉價(jià)的，基于比色紙的ELISA檢測方法，由于紙基質(zhì)的高表面體積比，每次僅需幾微升的人血清即可完成，將1～2 h的常規(guī)ELISA操作時(shí)間縮短到30 min以內(nèi)，可檢測到每微升10 ng(0.124 μ/mL)的SARS-CoV-2人源抗體。

3.1.2 GICA

GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體檢測的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，該方法無需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理，僅需一滴血即可在15 min內(nèi)通過肉眼進(jìn)行觀察，從而獲得檢測結(jié)果[62]。Wang等[63]將膠體金標(biāo)記的病毒N蛋白和兔IgG抗體固定于結(jié)合墊，檢測線處同時(shí)固定抗人IgM和IgG抗體，質(zhì)控線處則固定抗兔IgG抗體。10 μL人血清樣品從加樣處隨緩沖液向試紙另一端移動(dòng)，樣品中的待測抗體與結(jié)合墊上膠體金標(biāo)記的N蛋白結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，隨后該復(fù)合物被檢測線上的抗人IgM和IgG抗體捕獲而顯色[63]。若待測樣品中不含待測抗體，則只有質(zhì)控線處顯色，該課題組在上述試劑盒的基礎(chǔ)上，將抗IgM和抗IgG抗體分為2條檢測線(圖3)，在一定程度上提升了檢測的靈敏度。但由于樣本量太小，該方法得到初步結(jié)果的靈敏度和特異性可能被高估。

圖3 膠體金免疫層析法同時(shí)檢測IgM/IgG的試劑盒工作示意[63]Fig.3 Schematic work of the detection kit for IgM/IgG by GICA[63]

3.1.3 CILA

CILA是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法則是引入納米磁微粒作為固定載體，以捕獲待測樣本中的IgM/IgG抗體[64-65]。這是一種比較先進(jìn)的免疫檢測技術(shù)，其自動(dòng)化程度高，相比ELISA和GICA，CILA具有更高的靈敏度和特異性[66-68]，但其需依賴大型儀器設(shè)備、成本更高、不適用于大規(guī)模的篩查[69]。

與分子生物學(xué)檢測相比，抗體檢測能以較低的成本提供更快的結(jié)果，更適合于即時(shí)檢測。臨床評(píng)估結(jié)果表明：ELISA、GICA和CILA這3種抗體檢測手段被應(yīng)用于COVID-19患者的診斷時(shí)，均具有良好的靈敏度和特異性[70-71]，但由于SARS-CoV-2進(jìn)入機(jī)體后，需經(jīng)過一定時(shí)間的潛伏期才會(huì)產(chǎn)生IgM與IgG抗體，這種滯后性容易導(dǎo)致較差的敏感性，因此，抗體檢測并不能替代RT-PCR對(duì)COVID-19的早期診斷[71]。此外，抗體檢測還存在一些干擾因素，例如：SARS-CoV-2與其他微生物支原體、病毒(尤其是其他冠狀病毒)等之間的交叉反應(yīng)性、用藥情況、血液中的非特異性IgM、類風(fēng)濕因子以及溶血所致的高濃度血紅蛋白等[72-75]，這些因素均會(huì)造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。基于以上原因，抗體檢測尚不宜作為判斷是否感染COVID-19的唯一依據(jù)，其更適合在核酸檢測陰性時(shí)作為輔助手段，為醫(yī)生提供重要的免疫學(xué)依據(jù)或用于評(píng)價(jià)疫苗的功能和接種效果。

3.2 抗原檢測

由于機(jī)體產(chǎn)生抗病毒的抗體存在滯后性，抗體檢測不能適用于人群篩查和感染初期的診斷，因此，開發(fā)用于病毒抗原的檢測方法對(duì)于遏制疾病大流行具有重要意義。FDA已于美國時(shí)間2020年5月11日發(fā)布了首個(gè)COVID-19抗原檢測試劑Sofia 2 SARS Antigen FIA的緊急使用授權(quán)(EUA)通知[76]。我國藥品監(jiān)督管理局則于2020年11月3日首次審批通過了2個(gè)抗原檢測試劑盒，分別為北京金沃夫生物工程科技有限公司開發(fā)的新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗原檢測試劑盒(乳膠法)和廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司開發(fā)的新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗原檢測試劑盒(膠體金法)[77]。乳膠法的原理是抗體或抗原致敏乳膠微球形成免疫乳膠，與相應(yīng)的抗原或抗體產(chǎn)生特異性的凝聚反應(yīng)，以檢測響應(yīng)抗原或抗體的存在[78]。膠體金抗原檢測的原理則類似于膠體金抗體檢測法，不同之處在于抗原檢測是將能夠結(jié)合待測抗原的抗體分別固定于免疫層析檢測試紙條的檢測線與結(jié)合墊上，其中結(jié)合墊上的抗體被膠體金所標(biāo)記，質(zhì)控線則固定的是二抗[79]。已有研究人員對(duì)國際上已獲批的抗原檢測試劑盒的測試效果進(jìn)行了評(píng)估[80-81]，結(jié)果顯示：大多數(shù)抗原檢測試劑盒的效果不如“金標(biāo)準(zhǔn)”qRT-PCR，不建議將其作為是否感染SARS-CoV-2的一線測試試劑，主要原因是抗原檢測不能像PCR一樣對(duì)病毒抗原進(jìn)行成倍擴(kuò)增，在病毒載量低的情況下容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而我國剛獲批的2種抗原試劑盒的效果還有待更深入的臨床評(píng)估。

Dai等[82]利用生物信息學(xué)和免疫信息學(xué)方法，預(yù)測了病毒N蛋白的潛在免疫優(yōu)勢區(qū)域?；诖蠖鄶?shù)流感病毒的N蛋白序列與SARS-CoV-2相似性較低，通過直接檢測N蛋白可以區(qū)分COVID-19和流感病毒感染。此外，考慮到SARS-CoV-2的全長N蛋白可能會(huì)與病毒感染患者的血清發(fā)生交叉反應(yīng)[83]，選用短的重組蛋白來開發(fā)診斷抗體，在保證免疫敏感性的前提下，可以降低交叉反應(yīng)的發(fā)生。Lin等[84]開發(fā)了一種微流控集成快速檢測分析平臺(tái)(圖4)，在15 min內(nèi)可以同時(shí)檢測SARS-CoV-2的IgG、IgM和抗原3種生物標(biāo)志物。該微流控免疫分析平臺(tái)具有集成且便捷的特點(diǎn)，有望被應(yīng)用于COVID-19的即時(shí)檢測。目前，該方法已獲得中國醫(yī)療器械評(píng)估中心(CMDE)的批準(zhǔn)和歐洲Conformite Europeenne(CE)的認(rèn)證[84]。與實(shí)際應(yīng)用中與其他對(duì)COVID-19的檢測方法相比，抗原檢測手段的主要顯著性優(yōu)勢在于：無需復(fù)雜儀器和專業(yè)人員的操作，成本低廉并且可以進(jìn)行即時(shí)檢測。一旦研究出有效的抗體，抗原檢測容易實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，因此，抗原檢測具有廣闊的發(fā)展空間和實(shí)用價(jià)值。

圖4 SARS-CoV-2的IgG/IgM/抗原熒光免疫微流控檢測平臺(tái)工作示意[84]Fig.4 Schematic illustration of the microfluidic immunoassays for IgG/IgM/antigen detection of SARS-CoV-2[84]

4 新型生物傳感器

4.1 基于局域表面等離子共振(LSPR)的生物傳感器

LSPR是一種光現(xiàn)象，當(dāng)光線的入射光子頻率與導(dǎo)電納米粒子的整體振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，光譜上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)共振吸收峰[85]。最近，Moitra等[86]針對(duì)SARS-CoV-2的N基因設(shè)計(jì)了一種特異性巰基修飾的，反義寡核苷酸所覆蓋的金納米顆粒(AuNPs)，該AuNPs僅在SARS-CoV-2存在時(shí)會(huì)發(fā)生聚集，并顯示出表面等離子共振的變化，核糖酶核酸酶H(RNase H)的添加進(jìn)一步促進(jìn)了AuNPs的團(tuán)聚，在10 min內(nèi)即可從視覺上觀察到沉淀，因此，可由此判斷是否感染SARS-CoV-2，其檢測限為0.18 ng/mol。

Qiu等[87]將等離子光熱效應(yīng)與LSPR結(jié)合，構(gòu)建了一種雙功能等離子生物傳感器，互補(bǔ)DNA功能化的二維金納米島(AuNIs)。通過核酸雜交對(duì)SARS-CoV-2的特定序列進(jìn)行高靈敏檢測。當(dāng)以等離子共振頻率照射時(shí)，AuNIs表面產(chǎn)生的等離子熱能能提供穩(wěn)定的熱源，以增強(qiáng)SARS-CoV-2與互補(bǔ)DNA的相互作用，從而提高靈敏度和選擇性，檢測限低至0.22 pmol/L，該生物傳感器出色的傳感性能允許其在多基因混合物中準(zhǔn)確測定出特定的靶標(biāo)物。

4.2 基于場效應(yīng)晶體管(FET)的生物傳感器

FET的生物傳感器因具有免標(biāo)記、靈敏度高和易于集成等優(yōu)勢，引起了眾多研究人員的關(guān)注。Seo等[88]開發(fā)了一種用抗病毒S蛋白的，具有特異性抗體覆蓋的石墨烯FET(圖5)，當(dāng)S蛋白與石墨烯表面的抗體結(jié)合時(shí)，石墨烯FET的電導(dǎo)/電阻可以發(fā)生改變，從而能夠獲得檢測結(jié)果。該FET設(shè)備的檢測限因樣品而異：磷酸鹽緩沖液和臨床運(yùn)輸介質(zhì)中的病毒S蛋白檢測質(zhì)量濃度分別為每毫升1和100 fg時(shí)，培養(yǎng)基和鼻咽拭子樣本的病毒檢測限分別為每毫升1.6×10 PFU和2.42×102copies[88]。該傳感平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是樣品不需要進(jìn)行預(yù)處理，且具有區(qū)分SARS-CoV-2和MERS-CoV抗原的能力。

圖5 COVID-19 FET傳感器操作程序的示意[88]Fig.5 Schematic procedure of COVID-19 FET sensor operation[88]

4.3 基于電化學(xué)的生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器通過電勢、電流、離子濃度、電導(dǎo)率、電容或阻抗的變化程度來反映目標(biāo)檢測物的含量[89]。Fabiani等[90]開發(fā)了一種電化學(xué)免疫測定法，以磁珠作為固定載體， 堿性磷酸酶作為免疫標(biāo)記的二抗，使用碳黑納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測酶促產(chǎn)物1-萘酚，可快速、智能的檢測唾液中的病毒S或N蛋白。該方法使用的樣品無需進(jìn)行預(yù)處理，S和N蛋白的檢測限分別為每毫升19和8 ng，儀器的小型化和便捷性，使其有潛力作為第一個(gè)無創(chuàng)且高靈敏進(jìn)行唾液檢測SARS-CoV-2的電化學(xué)免疫分析方法[90]。Alafeef等[91]創(chuàng)新性地將金納米顆粒與石墨烯結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種紙基電化學(xué)傳感芯片。其中，金納米顆粒用針對(duì)病毒N蛋白的特異性硫醇修飾的單鏈DNA(ssDNA)進(jìn)行封端，將其沉積于石墨烯導(dǎo)電膜上，以形成傳感探針，進(jìn)一步被固定于基于紙張的電化學(xué)平臺(tái)上，可在5 min內(nèi)檢測樣品量低至每毫升6.9 copies，該設(shè)備的讀數(shù)還可通過智能設(shè)備實(shí)時(shí)讀取[91]。這一方法的巧妙之處在于設(shè)計(jì)了4種可同時(shí)靶向于病毒N基因的2個(gè)獨(dú)立區(qū)域的ssDNA，具有良好的靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確地將COVID-19陽性樣品與陰性樣品或其他冠狀病毒樣品進(jìn)行區(qū)分，因此，即使病毒的基因組發(fā)生突變，該傳感器仍具有可行性。

4.4 基于熱致液晶(LCs)的生物傳感器

某種能形成液晶的固體經(jīng)加熱轉(zhuǎn)變成為既有雙折射性，又有流動(dòng)性的液晶態(tài)，被稱為LCs[92]。當(dāng)LC膜或液滴在其界面上吸附一些分子時(shí)，會(huì)發(fā)生取向性的變化，例如：ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)，使負(fù)載陽離子表面活性劑的LC產(chǎn)生不同的取向，從而導(dǎo)致不同的光學(xué)外觀變化(如暗色/亮色的變化)[93-94]。基于該原理，開發(fā)出了一種可裸眼檢測病毒ssRNA的，基于LC的便捷式診斷套件[92]。研究人員在LC表面覆蓋了陽離子表面活性劑DTAB和帶負(fù)電荷的單鏈探針核酸ssDNAprobe，此時(shí)LC呈傾斜或平行取向，且具有亮色的光學(xué)外觀[92]。當(dāng)樣本中存在SARS-CoV-2時(shí)，病毒ssRNA與ssDNAprobe雜交，使ssDNAprobe與DTAB的靜電作用減弱，導(dǎo)致DTAB重新覆蓋于LC表面，LC可在20 min內(nèi)完全恢復(fù)為垂直取向并呈現(xiàn)暗色[92]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：30 fM的病毒ssRNA即可觸發(fā)LC的有序變換，使用3個(gè)錯(cuò)配的病毒ssRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，該方法的靈敏度降低了7個(gè)數(shù)量級(jí)，說明該方法對(duì)病毒ssRNA表現(xiàn)出良好的選擇性。此外，研究人員利用偏光顯微鏡原理設(shè)計(jì)組裝出的便捷式診斷試劑盒，并開發(fā)出基于機(jī)器學(xué)習(xí)的自動(dòng)化判讀手機(jī)App，為人們?cè)诩抑芯涂梢詫?shí)現(xiàn)快速、可靠的診斷COVID-19提供了一條新思路。

5 總結(jié)與展望

SARS-CoV-2的迅速蔓延造成了全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生危機(jī)，給全球經(jīng)濟(jì)帶來了巨大影響，對(duì)COVID-19的快速、準(zhǔn)確診斷是疫情防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，qRT-PCR作為COVID-19最常用的確診方法和指標(biāo)，可靠性良好、但對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高、過程相對(duì)繁瑣且假陰性現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)。特異性抗體檢測則可以有效輔助qRT-PCR，但存在滯后性的特點(diǎn)，不適用于對(duì)潛伏期患者的診斷。相比之下，抗原檢測更適用于即時(shí)檢測，但因?yàn)椴荒軐?duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)增，其靈敏度和準(zhǔn)確性容易受限。最近，國內(nèi)外研究人員開發(fā)出的多種新型的生物傳感器，其靈敏度、特異性和便捷性等方面因各有優(yōu)勢，在即時(shí)檢測中具有很大的潛力。筆者認(rèn)為對(duì)SARS-CoV-2的檢測技術(shù)需要綜合考慮以下幾個(gè)關(guān)鍵因素：

1)準(zhǔn)確性和靈敏度。對(duì)人群進(jìn)行準(zhǔn)確篩查是疫情防控的首要步驟，而隨著時(shí)間推移，SARS-CoV-2基因組可能隨時(shí)發(fā)生變異，因此在開發(fā)檢測方法時(shí)，應(yīng)做好篩選工作，避開突變位點(diǎn)或者設(shè)計(jì)多個(gè)靶點(diǎn)，以提高檢測方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。

2)檢測時(shí)間。對(duì)病毒的快速檢測可以提高篩查的效率，能更快確診感染患者并及時(shí)實(shí)施隔離和治療。

3)檢測成本和便捷性。降低檢測成本有利于在低資源環(huán)境下的疫情防控，開發(fā)基于智能手機(jī)或視覺化的先進(jìn)傳感器則更適合于居家檢測。

4)穩(wěn)定性。不僅要求檢測方法具有穩(wěn)定性，其所需試劑也應(yīng)具有穩(wěn)定性，即方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

5)安全性。開發(fā)檢測技術(shù)的本質(zhì)目的在于助力疫情防控，要防止在檢測過程中樣品暴露所造成的潛在傳染危害。

相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，更多新型、精準(zhǔn)且快速的檢測技術(shù)也將會(huì)隨之出現(xiàn)，人類終將戰(zhàn)勝COVID-19疫情。