微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦急性毒性的研究

黃蘭英，張達(dá)娟，張樹林,通信作者，馬丞鴻，黃鶯

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392；2. 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是目前世界上最重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一，于1988年引入我國。因其具有適應(yīng)力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、生長快及適合高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，在我國養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展[1]。2019年全球?qū)ξr產(chǎn)量530萬噸左右，而我國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)181萬噸[2]，穩(wěn)居全球首位。在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖密度高、人工餌料大量投入等，養(yǎng)殖水體常呈現(xiàn)富營養(yǎng)化狀態(tài)，并極易引起藻類尤其是藍(lán)藻異常繁殖，從而產(chǎn)生以微囊藻（Microcystissp.）為主的藍(lán)藻水華并釋放微囊藻毒素（Microcystins，MCs），影響凡納濱對(duì)蝦的生長[3-4]。MCs是微囊藻屬、魚腥藻屬（Anabaenasp.）等藍(lán)藻產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[5]，具有嗜肝性[6]，可以破壞水生動(dòng)物的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞變形，引起肝功能失調(diào)[7-8]。MCs除積累在肝臟外，同時(shí)也存在于腎臟、膽囊、生殖腺、腸胃、肌肉等器官并產(chǎn)生生物毒性[9-10]，嚴(yán)重影響水生動(dòng)物的正常生長、繁殖及其他生理過程[11]。MCs在動(dòng)物體內(nèi)累積一般通過直接接觸（腮和皮膚）、攝入產(chǎn)毒藍(lán)藻或已經(jīng)積累毒素的動(dòng)植物[12-13]等途徑實(shí)現(xiàn)。MCs存在多種異構(gòu)體，以 MC-LR、MC-RR和MC-YR產(chǎn)量最大，分布最廣，研究最深入[8,14]，其中MC-LR為最常見且毒性最大[15]。因此，研究MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的半致死濃度及毒性作用機(jī)制具有一定意義。不同生物對(duì)MCs的耐受性不同，與哺乳動(dòng)物相比，魚類對(duì)MCs具有更強(qiáng)的耐受性[16]，如與家兔（Oryctolagus cuniculus）相比，鯽魚（Carassius auratus）表現(xiàn)出對(duì)MC-LR更強(qiáng)的耐受性[17]。同種生物不同個(gè)體大小對(duì)MC-LR的耐受性也不同，如 GON?ALVES-SOARES等[18]研究了 MC-LR 注射（11.0±1.9）g凡納濱對(duì)蝦96 h的LC50為100 μg/kg；王鑫[19]表明MC-LR對(duì)（2.1±0.5）g凡納濱對(duì)蝦的LC50為123.21 μg/kg。雖然目前已有微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦半致死濃度的研究報(bào)道，但受試對(duì)蝦規(guī)格集中在2～15 g，缺少20 g及以上規(guī)格凡納濱對(duì)蝦的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究以20 g左右凡納濱對(duì)蝦為試驗(yàn)對(duì)象，采用不同濃度的MC-LR進(jìn)行注射感染，計(jì)算不同濃度 MC-LR感染情況下凡納濱對(duì)蝦的死亡率及LC50，為凡納濱對(duì)蝦的科學(xué)養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦購于天津?yàn)I海新區(qū)海通江洋水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，體長（15.0±0.5）cm，體重（20±1）g，試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5 d，暫養(yǎng)期間每天喂食1次，試驗(yàn)前24 h停止喂食。試驗(yàn)用水為曝氣 24 h后的自來水，海水晶調(diào)配鹽度至（7～8）‰，水溫（22±1）℃，溶解氧（7～8）mg/L，pH 8.0～8.5。暫養(yǎng)期間每天更換1/3體積水，暫養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)挑選大小一致、健康有活力的凡納濱對(duì)蝦用于急性毒性試驗(yàn)。

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品（MC-LR）購于臺(tái)灣Express（Express Technology Co.Ltd）公司，純度≥95%。毒性試驗(yàn)前將標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)處理組，處理組分別注射濃度為50、100和200 μg/kg（每千克蝦注射MC-LR量）磷酸緩沖液（PBS）溶解的MCLR，對(duì)照組不注射MC-LR（注射等體積 PBS），注射部位為對(duì)蝦第二腹節(jié)下血竇處，注射劑量20 μL。各處理組及對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行分別投放30尾蝦。試驗(yàn)期間不喂食，其他養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時(shí)相同。從注射后開始，每4 h記錄對(duì)蝦死亡個(gè)數(shù)并及時(shí)剔除死亡個(gè)體（以對(duì)蝦側(cè)倒且附肢不運(yùn)動(dòng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)），記錄96 h內(nèi)對(duì)蝦死亡數(shù)。

1.2.2 微囊藻毒素配制及注射

MC-LR 用 PBS（NaCl 8 g，Na2HPO42.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g；蒸餾水定容至1 000 mL）溶解至一定體積配制成母液。按試驗(yàn)各處理組將母液配置為對(duì)應(yīng)三個(gè)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2010整理后，使用SPSS 26.0軟件中Probit程序計(jì)算24、48、72和96 h的LC50及相應(yīng)的95%置信區(qū)間，并計(jì)算藥物毒性蓄積程度系數(shù)（MAC）[20]用于分析生物體對(duì)MC-LR蓄積和降減動(dòng)態(tài)。安全濃度（SC）的計(jì)算公式如下：

SC=0.1 ×96 hLC50

式中96 h LC50為凡納濱對(duì)蝦感染MC-LR96 h后的半致死質(zhì)量濃度值。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，不同濃度MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響不同。在96 h的急性毒性試驗(yàn)過程中，對(duì)照組中對(duì)蝦未出現(xiàn)死亡情況，各濃度處理組對(duì)蝦死亡率隨 MC-LR濃度增加和試驗(yàn)時(shí)間延長而上升。200 μg/kg MC-LR濃度組96 h死亡率為19%。

表1 不同濃度MC-LR注射凡納濱對(duì)蝦后24、48、72和96 h死亡率 %

MC-LR急性侵染凡納濱對(duì)蝦時(shí)間越長，半致死濃度越低，MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦24、48、72、96 h的LC50分別為 439.99、384.66、346.66、320.66 μg/kg。MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度為32.07 μg/kg，藥物毒性蓄積系數(shù)均為正值，分別為46.37%、31.84%及21.79%（表2）。

表2 MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性特征分析

3 討論

MCs嚴(yán)重影響水生動(dòng)物生長繁殖，限制水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展。目前已有大量MCs對(duì)浮游動(dòng)物、蝦、蟹和魚類毒性作用研究[21-24]。半致死濃度是衡量毒素對(duì)動(dòng)物急性毒性作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵指標(biāo)，半致死濃度與毒素毒性作用呈負(fù)相關(guān)。研究MCs對(duì)水生動(dòng)物的半致死濃度為水生動(dòng)物對(duì)MCs抗性研究提供依據(jù)。不同生物對(duì)MC-LR的耐受性不同，張學(xué)振研究表明 MC-LR對(duì)鯽魚與家兔的半致死濃度分別為250和33 μg/kg[17]，鯽魚表現(xiàn)出對(duì)毒素有更強(qiáng)耐受性。MC-LR對(duì)白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、羅非魚（Oreochromis niloticus）的半致死濃度分別為270和790 μg/kg，羅非魚表現(xiàn)出對(duì)毒素有更強(qiáng)耐受性[25]；MC-LR對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體12 h及 24 hLC50分別為 30.3（28.0-33.0）及 9.5（8.8-10.4）μg/mL[26]。MC-LR對(duì)不同種類的生物生化影響機(jī)制可能不同，所以不同生物對(duì)MC-LR的敏感度不同。本研究以0、50、100、200 μg/kg MC-LR注射凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦24、48、72和96 h的LC50（95%置信限）分別為 439.99（320.65～726.22）、384.66（288.428～625.669）、346.66（264.503～553.518）和 320.66（246.464～507.745）μg/kg。研究結(jié)果表明凡納濱對(duì)蝦對(duì)MC-LR具有較強(qiáng)的耐受性。

許多研究表明不同種生物對(duì) MC-LR的耐受性不同，但同種生物不同個(gè)體大小對(duì)MC-LR的耐受性情況鮮有報(bào)道。MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的LC50隨對(duì)蝦個(gè)體大小及感染 MC-LR的時(shí)間不同而不同（表3）。同種生物不同生長發(fā)育階段及不同個(gè)體大小對(duì)外界刺激的耐受程度不同[27-28]，凡納濱對(duì)蝦不同個(gè)體大小對(duì)MC-LR耐受程度不同。

表3 MC-LR對(duì)不同規(guī)格大小凡納濱對(duì)蝦急性毒性作用

毒物在生物體內(nèi)的蓄積與降減程度是分析生物耐毒能力和評(píng)價(jià)毒物毒效的基礎(chǔ)。藥物毒性蓄積程度系數(shù)常用來分析生物體對(duì)毒物的蓄積與降減動(dòng)態(tài)[30]，其值越大，毒效蓄積程度越大，生物抗毒能力越小，致死率越大；其值為正值時(shí)，蓄積作用強(qiáng)度大于降減作用；其值為負(fù)值時(shí)，降減作用強(qiáng)度大于蓄積作用。本研究表明，MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的藥物毒性蓄積程度系數(shù)均為正值，表明 MC-LR在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的蓄積作用大于降解作用，且在24～48 h時(shí)出現(xiàn)最大值，表明這個(gè)時(shí)間段 MC-LR在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的蓄積作用，即為死亡高峰階段。過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數(shù)下降，表明凡納濱對(duì)蝦對(duì)MC-LR的抵抗能力上升，毒性減弱。

水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻水華爆發(fā)，藍(lán)藻爆發(fā)產(chǎn)生的MCs對(duì)凡納濱對(duì)蝦等水生生物的安全產(chǎn)生影響。低劑量 MCs對(duì)水生生物不具有致死效應(yīng)，但易在水生生物體內(nèi)富集[31-32]，PRIETO等研究發(fā)現(xiàn)，低劑量MC-LR則會(huì)使機(jī)體經(jīng)過長時(shí)間誘導(dǎo)而使機(jī)體產(chǎn)生防御反應(yīng)，這種防御反應(yīng)被解釋為機(jī)體應(yīng)對(duì)MCs感染而表現(xiàn)出的一種補(bǔ)償機(jī)制，表現(xiàn)為抗氧化酶活性增加[33]。因此，低劑量MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦不具有致死效應(yīng)，但會(huì)使對(duì)蝦對(duì)MC-LR的耐受性增強(qiáng)。本研究所用凡納濱對(duì)蝦于7月底取自室外池塘，隨著大量餌料投入導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化及氣溫升高，藍(lán)藻生物量及藻毒素釋放量升高。本研究中凡納濱對(duì)蝦對(duì)MC-LR表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，可能是由于凡納濱對(duì)蝦在池塘中受到低濃度MC-LR感染而產(chǎn)生防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

凡納濱對(duì)蝦對(duì)不同濃度 MC-LR表現(xiàn)出梯度致死效應(yīng)，其死亡數(shù)隨MC-LR濃度升高而增大。MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦24、48、72和96 h的LC50分別為 439.99、384.67、346.66 和 320.66 μg/kg，表明凡納濱對(duì)蝦對(duì) MC-LR具有較強(qiáng)的耐受性。MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦的藥物毒性蓄積程度系數(shù)表明，MC-LR在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的蓄積作用大于降解作用，在24～48 h出現(xiàn)死亡高峰階段，過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數(shù)下降，表明凡納濱對(duì)蝦對(duì)MC-LR的抵抗能力上升。