產(chǎn)朊假絲酵母富硒條件的優(yōu)化及發(fā)酵罐培養(yǎng)

馬楚楚，陳帥君，趙寶頂，唐倫霞，童應(yīng)凱，邊嘉賓

（天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津 300392）

硒元素是1817年由ALLAN等[1]首次發(fā)現(xiàn)，在之后的幾十年里，硒被認為是一種有毒的重金屬物質(zhì)，高劑量的硒對生物體有較大的毒性和致癌性[2]。但在1949年，CLAYTON等[3]研究發(fā)現(xiàn)，攝入適量的硒能夠減少腫瘤的發(fā)生率。1957年，SCHWARZ等[4]通過大鼠試驗證明在食物中加入適量的硒能夠阻止肝臟壞死。1973年，TURNER等[5]證實硒元素是組成甘氨酸還原酶系統(tǒng)的必需元素。1976年，對該酶硒蛋白組分的化學特征進行研究，證實了有機硒組分為硒代半胱氨酸[6]。

缺硒會引發(fā)許多疾病，如抑郁癥、心血管疾病、腫瘤、甲狀腺功能紊亂、病毒性疾病（如流行性感冒，HIV，埃博拉），精子活性低等[7-9]。補充適量的硒可有效預(yù)防此類疾病的發(fā)生。1988年，我國把硒元素列為食物中必需的營養(yǎng)元素之一[10]。當今富硒產(chǎn)品主要有富硒植物、富硒雞蛋、富硒牛奶和富硒酵母，其中最常見的市售硒源是富硒酵母[11]。

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）可以產(chǎn)生大量單細胞蛋白，作為美國食品藥品監(jiān)督管理局評價食品添加劑安全性指標（Generally regarded as safe，GRAS）微生物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景[12]。本研究以產(chǎn)朊假絲酵母為出發(fā)菌株，向酵母培養(yǎng)液中加入一定量的Na2SeO3，通過酵母的生物轉(zhuǎn)化作用，把無機硒轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C硒[13]，以獲得富硒產(chǎn)朊假絲酵母，將其制備成飼料添加劑飼喂家畜家禽，從而獲得富硒農(nóng)產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（C. utilis），保藏于天津農(nóng)學院生物技術(shù)系微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L，硫酸銨8.0 g/L，磷酸二氫鉀3.0 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，pH 6.0。

補料培養(yǎng)基：葡萄糖150 g/L，硫酸銨18 g/L，磷酸二氫鉀6.75 g/L，硫酸鎂1.125 g/L（滅菌時，葡萄糖與其他成分分開滅菌）。

1.1.3 儀器設(shè)備

可見分光光度計（UNIC-UV2100）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052B，上海一恒科學儀器有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30FBS，上海申安醫(yī)療器械廠）、電子天平（ACR120，梅特勒-托利多儀器）、搖床（HNY-2112F，天津歐諾儀器股份有限公司）、電熱鼓風干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科學儀器有限公司）、離心機（LXJ-IIB，飛鴿牌）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，瑞華儀器制造有限公司）。

1.1.4 藥品

亞硒酸鈉、硫酸鎂、亞硒酸、鹽酸苯肼、變色酸、3，5-二硝基水楊酸，成都艾科科技有限公司；EDTA二鈉、氯酸鉀、高氯酸、濃鹽酸、濃硝酸、葡萄糖、重苯酚、亞硫酸鈉、硫酸氫二鉀，國藥集團化學試劑有限工商網(wǎng)；酵母浸出膏、蛋白胨、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株生長曲線的繪制

將石蠟管封存的菌種接種在斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后挑取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后按8%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后每2 h取樣1次，樣品稀釋10倍，測定在600 nm處的吸光度，繪制標準曲線。

1.2.2 硒質(zhì)量濃度對酵母富集有機硒的影響

設(shè)置初始硒質(zhì)量濃度為0，5，10，15，20，25，30 μg/mL，裝液量為40 mL/250mL廣口三角瓶（下同），初始pH 6.0，培養(yǎng)時間35 h，溫度29 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。在發(fā)酵對數(shù)期后期（12 h）向培養(yǎng)基中添加Na2SeO3[14]，發(fā)酵至35 h時，取出發(fā)酵液，離心洗滌3次，測定生物量和硒含量。

1.2.3 硒添加方式對酵母富集有機硒的影響

設(shè)置5組試驗方案：①在12 h一次性添加10 μg/mL Na2SeO3；②分別在12 h 和 16 h 添加5 μg/mL Na2SeO3；③在 12 h 一次性添加 15 μg/mL Na2SeO3；④分別在12 h和16 h添加5 μg/mL和10 μg/mL Na2SeO3；⑤分別在12 h和16 h添加10 μg/mL和5 μg/mL Na2SeO3。發(fā)酵條件按照1.2.2試驗中最優(yōu)方案操作。

1.2.4 初始pH對酵母富集有機硒的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，發(fā)酵條件按照1.2.3試驗中最優(yōu)方案操作，發(fā)酵完畢后測定生物量和硒含量。

1.2.5 搖瓶裝液量對酵母富集有機硒的影響

設(shè)置裝液量分別為30、35、40、45、50、55、60 mL 7個梯度，試驗方案按照1.2.4試驗中最優(yōu)方案操作，發(fā)酵完畢后測定生物量和硒含量。

1.2.6 正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗，選擇硒質(zhì)量濃度（μg/mL），接種量（%），培養(yǎng)基初始 pH，裝液量（mL）4個因素，制定3個水平，進行L9（34）正交試驗，正交試驗表如表1所示。

表1 正交試驗實施表

1.2.7 發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

試管斜面活化12 h后接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，然后按10%接種量接于發(fā)酵罐中，裝液量為4 L/7 L發(fā)酵罐，溫度為29 ℃，通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH進行調(diào)節(jié)，pH恒定為5.5，初始攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，溶氧控制在30%，接種0.5 h后與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)。每2 h取一次樣，測定糖含量和生物量。

1.2.8 發(fā)酵罐分批補料培養(yǎng)

前期同分批培養(yǎng)，在葡萄糖消耗完后以 100 mL/h流加補料培養(yǎng)基補料10 h。每2 h取樣一次，測定生物量和殘?zhí)橇俊?/p>

1.2.9 發(fā)酵罐分批補料加硒試驗

培養(yǎng)條件與方法同分批補料培養(yǎng)，在26 h和37 h 分別加入 Na2SeO320 μg/mL 和 10 μg/mL，測定硒含量。

1.3 指標分析方法

1.3.1 酵母生物量（DCW）的測定[14]

取30 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，蒸餾水離心漩渦震蕩洗滌3次，將得到的濕菌體于80 ℃烘箱中烘干至恒重，計算酵母細胞干重。

1.3.2 葡萄糖濃度的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法[15]。

1.3.3 硒含量的測定

采用催化分光光度法[16]。

發(fā)酵液中總有機硒含量（μg/L）＝菌體有機硒（μg/g）×DCW（g/L）

發(fā)酵液中有機硒得率/%＝發(fā)酵液中總有機硒含量（μg/L）/初始添加的無機硒質(zhì)量濃度（μg/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長曲線

研究表明，酵母細胞在對數(shù)期吸收硒的能力最高[17]。由菌株生長曲線可知，酵母在培養(yǎng) 12 h時開始由對數(shù)期進入穩(wěn)定期（圖1）。因此選擇在培養(yǎng)時間12 h時加入無機硒Na2SeO3。

圖1 菌體生長曲線

2.2 硒質(zhì)量濃度對酵母富集有機硒的影響

由圖2可知，在硒質(zhì)量濃度0～30 μg/mL范圍內(nèi)，隨著硒質(zhì)量濃度的增加，酵母生物量逐漸下降，由9.893 g/L下降至3.908 g/L，可見無機硒對酵母的生長具有抑制作用，且質(zhì)量濃度越大，這種抑制作用越強。在硒質(zhì)量濃度為25 μg/mL和30 μg/mL時，發(fā)酵液顏色略顯紅色，這是由于處于較高的質(zhì)量濃度時，無機硒被還原為單質(zhì)硒，致使發(fā)酵液顏色呈紅色。在硒質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，總有機硒含量最高，達到9 954.4 μg/L，但有機硒得率（49.77%）和生物量（4.75 g/L）普遍比硒質(zhì)量濃度為15 μg/mL（有機硒得率56.8%，生物量5.84 g/L）時偏低。由于所獲得的產(chǎn)品為菌液，在獲得有機硒越來越多的同時，應(yīng)保證菌液中無機硒不能增長過快，否則對飼養(yǎng)動物有較大毒害作用。因此，選擇15 μg/mL為最適硒添加質(zhì)量濃度。

圖2 硒質(zhì)量濃度對酵母富集有機硒的影響

2.3 硒添加方式對酵母富集有機硒影響

由圖3可知，從發(fā)酵液中總有機硒含量、DCW兩個指標來看，在培養(yǎng)12 h一次性加入無機硒15 μg/mL時，兩個指標在5組數(shù)據(jù)中均最高。因此，在后續(xù)試驗中，選擇培養(yǎng)12 h時一次性加入無機硒 15 μg/mL。

圖3 硒添加方式對酵母富集有機硒的影響

2.4 初始pH對酵母富集有機硒的影響

pH對酵母細胞膜的透性有重要影響，從而影響酵母對硒元素的生物轉(zhuǎn)化。由圖4所示，初始pH對酵母生物量及硒富集量均有一定的影響。pH過低或過高都會抑制酵母的生長和對硒的吸收，當培養(yǎng)基初始pH值為6.0時，發(fā)酵液中總有機硒含量最高。因此，后續(xù)試驗中培養(yǎng)基適宜的初始pH為6.0。

圖4 初始pH對酵母富集有機硒的影響

2.5 搖瓶裝液量對酵母富集有機硒的影響

由圖5可知，搖瓶裝液量越多，越有利于菌株對硒的富集，但得到的生物量較少，而搖瓶裝液量越少，菌體對硒的富集量越少，但有較高的生物量。根據(jù)發(fā)酵液中總有機硒曲線，可知當裝液量為40 mL時，其發(fā)酵液中總有機硒含量較高，達到 9 821.75 μg/L。因此，選擇最適裝液量為40 mL。

圖5 搖瓶裝液量對酵母富集有機硒的影響

2.6 正交試驗結(jié)果分析

張帆等[18]研究表明，在單因素試驗基礎(chǔ)上，Na2SeO3質(zhì)量濃度、初始pH和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)朊假絲酵母富硒工藝的影響較大，本試驗選取這3個因素對提取工藝進行優(yōu)化。由表2可見，在發(fā)酵液中總有機硒和菌體有機硒的影響因素方面，各因素所占比重有所不同，5號試驗組的發(fā)酵液中總有機硒含量最高，達到9 792.732 μg/L，8號試驗組的菌體有機硒含量最高，為2 643.071 μg/g。以發(fā)酵液中總有機硒含量為分析對象，各因素的比重大小依次為：硒質(zhì)量濃度＞接種量＞裝液量＞初始pH。以發(fā)酵液中總有機硒含量來看，5號試驗組最好，可以達到菌體有機硒含量和生物量之間的平衡，即：硒質(zhì)量濃度15 μg/mL、接種量8%、初始pH 6.5、裝液量為35 mL。此時發(fā)酵液中的總有機硒含量為9 792.732 μg/L，菌體有機硒含量為1 400.362 μg/g。

表2 正交試驗結(jié)果分析表

以菌體有機硒為分析對象，各因素的比重大小依次為：硒質(zhì)量濃度＞初始pH＞裝液量＞接種量，并且硒質(zhì)量濃度是兩個指標的最重要影響因素。這是因為硒質(zhì)量濃度越大，對生物量產(chǎn)生的抑制作用越大，造成生物量減少，雖然單位菌體有機硒含量高，但生物量較少，導(dǎo)致發(fā)酵液中總有機硒含量也不是很高[19]。

2.7 分批培養(yǎng)結(jié)果分析

由圖 6可知，產(chǎn)朊假絲酵母開始發(fā)酵在第 6小時進入對數(shù)期，葡萄糖消耗明顯加快，直到發(fā)酵12 h時糖量基本耗盡，在18 h后生物量趨于穩(wěn)定，并在24 h時達到最大，為13.07 g/L。因此，在分批補料培養(yǎng)時，在12 h左右開始補料為宜。

圖6 分批培養(yǎng)生物量和殘?zhí)橇?/p>

2.8 分批補料培養(yǎng)結(jié)果分析

補料分批培養(yǎng)比分批培養(yǎng)具有明顯的優(yōu)勢[20]，這種培養(yǎng)方式解除了底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)，從而提高了產(chǎn)率。由圖 7可知，葡萄糖在11 h時基本耗盡，此時開始補料。在開始補料前6小時殘?zhí)橇刻幱谳^低水平，但在后4小時殘?zhí)橇可仙^快，并在停止補料后殘?zhí)橇烤徛陆怠３醪椒治鲈谘a料前6小時酵母迅速繁殖，對發(fā)酵液中的溶解氧要求越來越多，而在補料后期發(fā)酵罐中溶解氧滿足不了菌量的需求，補料時溶解氧降至0，酵母細胞在缺氧條件下，菌體進行無氧呼吸，葡萄糖利用率下降，不再進行繁殖，這可能也是在補料后期殘?zhí)橇可仙脑蛑?，此時很難獲得較高的生物量[21]。發(fā)酵罐供氧不足也是影響酵母高密度培養(yǎng)的一個重要因素。在后續(xù)試驗中，可以利用純氧來緩解供氧的不足。

圖7 分批補料培養(yǎng)生物量和殘?zhí)橇?/p>

2.9 分批補料加硒試驗結(jié)果分析

由表3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，36 h和48 h時總有機硒含量和有機硒得率均比30 h和42 h高，在48 h時發(fā)酵液中總有機硒含量為10 089.00 μg/L。

表3 分批補料加硒試驗結(jié)果分析表

3 結(jié)論

本文以產(chǎn)朊假絲酵母為研究對象，將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，研究硒質(zhì)量濃度、硒添加方式、初始pH、搖瓶裝液量對酵母富集硒的影響，以這些單因素的試驗結(jié)果來分析設(shè)計L9（34）正交表以進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，獲得發(fā)酵液中總有機硒含量最高時的培養(yǎng)條件，即：硒質(zhì)量濃度15 μg/mL、接種量8%、初始pH 6.5、裝液量為35 mL，此時總有機硒含量為9 792.732 μg/L，相比于鄒艷等[22]的總有機硒含量為8 790 μg/L有所提高。菌體有機硒最高時的條件為：硒質(zhì)量濃度20 μg/mL、接種量8%、初始pH 5.5、裝液量45 mL，菌體有機硒含量為2 750.41 μg/g，此時生物量為3.1 g/L。本研究在發(fā)酵罐分批培養(yǎng)過程中也獲得比較滿意的結(jié)果，但在獲得高濃度菌體方面還有待于進一步研究優(yōu)化。