天然植保劑大蒜素的提取及保鮮效果研究

柴嫚青 ，李香香 ，王銳 ，張靜靜 ，田琳 ，徐曉萍 ,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300392；2. 華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

大蒜中包含人體必需的微量元素硒、鋅、鍺等[1]，也包括脂溶性有機(jī)硫化物、硫代亞磺酸酯類等揮發(fā)性物質(zhì)[2]和水溶性有機(jī)硫化物、類固醇皂苷等非揮發(fā)性物質(zhì)等[3]。其中大蒜素是大蒜中最具有活性的物質(zhì)，圖1所示為大蒜素的結(jié)構(gòu)[2]。大蒜素為淡黃色油狀液體，有刺激性臭味。冷凍處理是所有試驗預(yù)處理中最為穩(wěn)定的處理方式，對大蒜的活性物質(zhì)含量和抗氧化性影響微弱，可以作為工廠加工首要選擇的處理條件[4]。大蒜適當(dāng)延長采收時間有助于大蒜素的累積并且提高其辛辣度[5]。

圖1 大蒜素結(jié)構(gòu)

目前大蒜素的提取方法有水蒸氣蒸餾法[6]、超臨界 CO2提取法[7]和有機(jī)溶劑提取法[8]。本試驗采用有機(jī)溶劑提取法，選用乙醇溶劑[9]，通過正交試驗確定提取的最適宜條件，利用超聲提取以提高提取率[10]。大蒜素含量的測定方法有定硫法[11]、硝酸汞法、吸光光度法和HPLC法[12]。本試驗采用吸光光度法測定大蒜素含量，通過測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大蒜素含量。

大蒜經(jīng)破碎，蒜酶活化，催化蒜氨形成大蒜素，大蒜素進(jìn)一步分解成具有強(qiáng)烈臭味的硫化物[13]，正是這些硫化物使大蒜具有抗菌消炎、抗癌、治療和預(yù)防心血管疾病、提高體細(xì)胞的免疫功能和保護(hù)肝臟[14-16]、抑制病菌的生長和繁殖作用[17-18]等功效，且使病菌不易產(chǎn)生抗藥性。大蒜素在農(nóng)業(yè)上作為殺蟲劑、殺菌劑，效果顯著，是一種天然的植保劑，也用于食品[19]、飼料[20-22]、醫(yī)藥上，大蒜素使用后在植物中的殘留量遠(yuǎn)低于人體每日從大蒜中攝取的量，因此可將其用于農(nóng)藥、水果和食品保鮮，其作用強(qiáng)度相當(dāng)于甚至強(qiáng)于苯甲酸和山梨酸等化學(xué)防腐劑[23]，目前經(jīng)常使用的水果保鮮劑有用于柑橘類保鮮的碳酸氫鈉、用于梨類水果保鮮的虎皮靈和用于蘋果類保鮮的甲基托布津等[24]。閔玉濤等[25]、曹薇[26]、張黎明等[27]也研究了大蒜素在水果保鮮方面的應(yīng)用，試驗結(jié)果顯示大蒜素對于水果保鮮確實有很好的效果。本研究擬研究大蒜素的提取工藝以及保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器

FA1204B電子天平；恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用有限責(zé)任公司）；BK-600D超聲波清洗機(jī)（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；TDZ5-WS離心機(jī)（長沙湘銳離心機(jī)有限公司）；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.1.2 試驗原料與試劑

大蒜（購于天津王頂?shù)淌袌觯粺o水乙醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠分析純）；標(biāo)準(zhǔn)大蒜素（上海源葉生物科技有限公司UV≥98%）。

1.2 大蒜素提取過程

本試驗利用有機(jī)溶劑提取法提取大蒜素，有機(jī)溶劑選用 85%的乙醇溶液。先將新鮮大蒜搗碎成泥狀，稱取5 g左右的蒜泥于錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴鍋中，水浴后加入乙醇溶液進(jìn)行超聲，超聲后在3 000 r/min條件下離心15 min，將上清液置于燒杯中。取1 mL上清液于比色管中定容后再取稀釋后的溶液1 mL于比色管中定容，進(jìn)行兩次稀釋后在最大吸收波長處測定大蒜提取液的吸光度。記錄各個條件下的吸光度。

1.3 大蒜素最大吸收波長的確定

將大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在 85%乙醇中，制成一定濃度的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計得到紫外全波長掃描圖。通過大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紫外譜圖得到大蒜素紫外最大吸收波長，同時對比兩個紫外譜圖。

1.4 正交試驗

提取溫度、提取時間、料液比、超聲溫度以及超聲時間對于大蒜素的提取率都有影響，料液比在 1∶5、1∶6[8，28-29]，提取的適宜溫度在 40～45 ℃，時間在 60～70 min 范圍內(nèi)[8，12，30]，超聲的溫度在 35～45 ℃，時間在 50～60 min[12，28，30-31]，因此選用五因素四水平制定正交表格（表1）進(jìn)行正交試驗。并依據(jù)正交試驗結(jié)果進(jìn)一步確定大蒜素提取的最適宜條件。

表1 正交試驗影響因素水平表

1.5 依據(jù)紅外光譜確定大蒜素結(jié)構(gòu)

在45 ℃提取50 min，加入30 mL 85%乙醇混合均勻后在600 W，45 ℃條件下超聲50 min得到大蒜提取液，將提取液在R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到淡黃色油狀液體，利用FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀對大蒜提取液進(jìn)行紅外測定，利用液膜法，取1～2滴大蒜提取液置于兩個圓形鹽片中間，形成一層液膜，放入光路檢測，得到大蒜提取液紅外譜圖。將20 mg大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL的容量瓶中制成0.2 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，與大蒜提取液同樣的方法，利用紅外測定大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖。對比大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紅外譜圖和紅外譜圖確定大蒜提取液的官能團(tuán)。

1.6 室溫下大蒜素保存時間試驗

將大蒜樣品在 45 ℃水浴鍋中水浴提取 80 min，加入25 mL 85%乙醇在40 ℃溫度下超聲40 min后離心，取上清液稀釋后測定吸光度，將在該條件下得到的大蒜提取液再放置幾天后測定吸光度計算大蒜素含量，觀察在室溫下大蒜素含量變化情況。

1.7 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對比

發(fā)芽的大蒜是將新鮮大蒜去掉外皮后在冰箱放置20 d后大蒜根部長出白芽，取一定量新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜，分別在表2所示的條件下測定對應(yīng)吸光度并計算大蒜素含量。

表2 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對比條件

1.8 大蒜提取液對蔬菜和水果保鮮效果試驗

試驗在溫度為 21 ℃，相對濕度為 25%的條件下進(jìn)行。設(shè)置噴灑大蒜提取液、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇溶液以及空白對照，做6組平行試驗，對新鮮的菠菜、蘋果和香蕉進(jìn)行保鮮試驗。觀察樣品的情況。根據(jù)樣品表面的腐壞情況判斷大蒜素提取液對蔬菜和水果的保鮮效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素最大吸收波長

將大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長掃描得到的紫外光譜圖進(jìn)行對比如圖2所示，大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液均在198 nm和212 nm有吸收峰，最大吸收峰在198 nm，所以大蒜素的最大吸收波長為198 nm，兩個紫外光譜圖重合程度較好，吸收峰均相同。

圖2 大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長掃描圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在測定出大蒜提取液的吸光度后，想要確定大蒜素含量則需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照2.5所述的方法制備大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 0.2 mg/mL 的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL比色管中，定容后制成0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020和0.024 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.25 mL 0.2 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL容量瓶中定容制成0.001 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最大吸收波長處測定各個濃度大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出線性回歸方程，系統(tǒng)誤差為0.102，去除系統(tǒng)誤差后線性回歸方程為y＝23.946 0x＋0.057 8，R2＝0.994 2，相關(guān)性較好（圖3）。

圖3 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 正交試驗結(jié)果

通過進(jìn)行五因素四水平的正交試驗，得到各個正交條件下大蒜素的提取率，試驗結(jié)果如表 3所示。

表3 正交試驗結(jié)果

依據(jù)表3中K值大小可知，大蒜素提取率最高的組合是A4B3C2D1E2，即大蒜素提取的最適宜條件是提取溫度50 ℃，提取時間70 min，料液比1∶5，超聲溫度30 ℃，超聲時間50 min。且依據(jù)R值得到大蒜素提取率影響因素的影響大小是 A＞C＞E＞B＞D，即提取溫度＞料液比＞超聲時間＞提取時間＞超聲溫度。在最適宜條件下進(jìn)行大蒜素提取得到吸光度為 0.416，大蒜素提取率為4.60%。

2.4 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖與大蒜提取液紅外光譜圖

大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的紅外光譜圖與大蒜提取液的紅外光譜圖對照如圖4所示。

圖4 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品與大蒜提取液的紅外光譜對比圖

大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖在 3 383 cm-1有吸收峰，由于大蒜素由乙醇溶液溶解，所以推測是乙醇或水的羥基吸收峰，在2 974 cm-1的吸收峰推測為末端雙鍵，在1 647 cm-1有吸收峰但強(qiáng)度比C＝＝O雙鍵的弱一些，推測為硫氧雙鍵，1 381 cm-1位于指紋區(qū)，推測為S＝＝O的伸縮振動吸收峰，1 087 cm-1和1 049 cm-1為S-S的吸收峰，879 cm-1為亞甲基的 C-H吸收峰，與大蒜素的結(jié)構(gòu)式基本符合。大蒜提取液的紅外譜圖在3 342 cm-1有一個寬的吸收峰，推測為乙醇或水的羥基吸收峰，2 931 cm-1的吸收峰推測為末端雙鍵，1 622 cm-1的吸收峰的強(qiáng)度沒有C＝＝O的吸收峰強(qiáng)度強(qiáng)，故推測為S＝＝O的吸收峰，1 406 cm-1位于指紋區(qū)，推測為S＝＝O的伸縮振動吸收峰，1 128 cm-1和1 026 cm-1有相鄰的2個吸收峰，推測為S-S的伸縮振動吸收峰，931 cm-1推測為亞甲基的C-H吸收峰。如圖4所示，大蒜提取液的紅外譜圖與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖各個吸收峰的重合程度高，并且與大蒜素的結(jié)構(gòu)式符合。結(jié)合大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品和大蒜提取液的紫外譜圖對比從而可以確定提取的物質(zhì)為大蒜素，并且提取液的紅外譜圖的峰較清晰，且雜峰不多，說明提取的大蒜素中雜質(zhì)含量較少。

2.5 室溫下大蒜素保存時間試驗

記錄室溫下放置的大蒜提取液的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出大蒜素含量如表4所示，發(fā)現(xiàn)大蒜素含量隨著放置時間的增加逐漸減少，第 8天大蒜素含量僅剩 0.26%。說明大蒜素易揮發(fā)，在室溫下保存時間不長，第8天大蒜素含量已經(jīng)很少了。

表4 室溫下保存時間試驗結(jié)果

2.6 新鮮和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對比

根據(jù)表2設(shè)計的試驗得到結(jié)果如表5所示，發(fā)芽大蒜里的大蒜素含量較新鮮大蒜里的大蒜素含量稍多，由于發(fā)芽大蒜中含有較多的抗氧化性的硒元素，可以減少自由基破壞，但發(fā)芽對于大蒜中大蒜素含量影響不大，最大相差 0.26%。發(fā)芽后大蒜內(nèi)的其他物質(zhì)含量有待進(jìn)一步測定。

表5 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對比 %

2.7 果蔬保鮮試驗

按照 2.8的試驗過程進(jìn)行蔬菜和水果保鮮試驗，如圖5所示，在菠菜試驗中，與第0天的新鮮菠菜相比，第4天空白對照有很明顯的縮水現(xiàn)象，而其他對照組的縮水現(xiàn)象不明顯，形狀幾乎沒變，噴灑乙醇溶液的菠菜變黃并且比噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)液的黃一些，大蒜素標(biāo)準(zhǔn)液的變黃程度更小一些。另外在噴灑乙醇溶液、大蒜提取液、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的菠菜中出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，而在空白對照中并沒有出現(xiàn)，推測為乙醇溶液可以提取菠菜中的色素，如圖 6所示。到第 9天時，6組均已經(jīng)呈現(xiàn)完全風(fēng)干狀態(tài)，且空白對照組中的菠菜葉已經(jīng)明顯縮皺，而其他各組大部分葉片大小形狀均保持較好。

圖5 菠菜保鮮試驗各個對照組結(jié)果對比圖

圖6 菠菜保鮮試驗中特殊脫色現(xiàn)象結(jié)果對比圖

如圖7所示，在蘋果的抗氧化試驗中，在30 min后，空白對照和噴灑乙醇溶液的蘋果表面有很明顯的氧化現(xiàn)象，噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果表面氧化現(xiàn)象不明顯，60 min后，各個對照組都有不同程度的氧化現(xiàn)象，氧化程度由大到小為：對照組，噴灑乙醇溶液組＞噴灑大蒜提取液組＞大蒜素純品溶液組。如圖8所示，在蘋果的表皮保鮮試驗中，到第4天，空白對照的蘋果表面有明顯縮水現(xiàn)象，噴灑乙醇溶液的蘋果有部分縮水現(xiàn)象，其他兩組的縮水現(xiàn)象不明顯，噴灑大蒜提取液和噴灑大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果表面形成一層黏膜，減少水分流失以及與空氣的接觸，使得噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果縮水現(xiàn)象不明顯，比噴灑乙醇溶液和空白對照的保鮮效果好。

圖7 蘋果抗氧化試驗各個對照組結(jié)果對比圖

圖8 蘋果表皮保鮮試驗各個對照組結(jié)果對比圖

在香蕉保鮮試驗中，如圖9所示，第4天時表皮有些許變黑，第9天時香蕉表皮已經(jīng)大面積變黑，但是噴灑有大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的香蕉表皮變黑面積較其他兩組對照少，第9天香蕉的內(nèi)部圖看出空白對照組有5組已經(jīng)壞掉，呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第1組已腐壞到不成型，噴灑乙醇溶液的對照組有4組呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第5組和第6組的香蕉頭部有明顯變黑現(xiàn)象，噴灑大蒜提取液的對照組有2組是呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，并且沒有其他組的那么嚴(yán)重，噴灑大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的對照組有 3組是呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第2組徹底壞掉，形狀軟榻。從以上水果試驗結(jié)果可以看出，大蒜素對于水果有很好的保鮮效果，并且在放置幾天后大蒜的味道仍有殘留，說明大蒜素并未完全揮發(fā)。大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和大蒜提取液的效果不能很好的區(qū)分可能是由于濃度的差異，后續(xù)可以進(jìn)行不同濃度大蒜素對于水果保鮮的效果試驗。

圖9 香蕉保鮮試驗各個對照組結(jié)果對比圖

3 結(jié)論

大蒜素紫外最大吸收波長為198 nm。大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，試驗結(jié)果較準(zhǔn)確，可用于測定大蒜素提取液中大蒜素含量。通過正交試驗的方法對大蒜提取液進(jìn)行吸光度的測定和數(shù)據(jù)分析，得到大蒜素提取的最適宜提取條件是提取溫度為 50 ℃，提取時間為70 min，料液比1∶5，超聲溫度為30 ℃，超聲時間為50 min。在最適宜條件下進(jìn)行大蒜素提取得到吸光度為0.416，大蒜素提取率為4.60%。大蒜素提取率影響因素的影響大小為提取溫度＞料液比＞超聲時間＞提取時間＞超聲溫度。通過菠菜、蘋果和香蕉的保鮮試驗，得到大蒜素對蔬菜和水果有很好的保鮮和抗氧化效果。

4 展望

本研究初步對蔬菜水果進(jìn)行保鮮和抗氧化試驗研究，由于大蒜便宜易得，且大蒜素對人體有較多益處，所以將大蒜素用于蔬菜水果保鮮有很大的應(yīng)用前景。提取得到的大蒜素是油狀液體，提純時在進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，液體會黏在燒瓶的瓶壁上，造成誤差較大，純度測定結(jié)果不可靠，所以本試驗未進(jìn)行純度測定，在后續(xù)大蒜素的研究中大蒜素的提純是很好的研究方向。