奶牛趾間皮膚外植體模型的構(gòu)建及效果評價

張鶴飛 周志新 孫 悅 楊春雪 鄭家三

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

奶牛肢蹄病是指由環(huán)境、管理、營養(yǎng)以及生理等多種不良飼養(yǎng)因素引起奶牛四肢及蹄部發(fā)生病變的總稱，其中蹄病約占90%以上[1]。近年來的調(diào)查結(jié)果顯示，我國各省份、地區(qū)奶牛肢蹄病的發(fā)病率可達14.6%～37.6%[2]，每年因肢蹄病被迫淘汰的奶牛占總數(shù)的20%[3]，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來重大的負擔。根據(jù)表現(xiàn)形式奶牛蹄病可分為感染性和非感染性兩類，常見的感染性蹄病主要包括由嚴格厭氧細菌、兼性厭氧細菌和需氧細菌感染引起的腐蹄病、蹄跟糜爛、蹄趾皮炎和趾間皮炎等[4]。當前對奶牛非感染性蹄病的臨床研究已有較為詳細的報道，而對感染性蹄病的研究報道相對較少。以往對奶牛蹄部感染性疾病的研究多采用活體試驗[5-6]，不僅給研究帶來諸多不便，而且違背動物福利原則，因此尋找一種可替代的離體試驗?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x。

皮膚外植體模型是以活體動物取下的皮膚組織(器官)為體外培養(yǎng)對象，構(gòu)建具有三維結(jié)構(gòu)的模型。作為體外研究的重要工具，皮膚外植體模型發(fā)展至今已有數(shù)十年歷史[7]，在此期間經(jīng)過不斷的優(yōu)化和改進，已成為當前替代動物試驗的熱點模型之一[8]，在皮膚體外研究領(lǐng)域中更是被視為金標準[9]。此類模型在保持皮膚相對完整性的同時，可進一步觀察皮膚組織細胞間在正常聯(lián)系和排列情況下的活性特征[10]，并通過免疫組化技術(shù)對細胞凋亡情況加以檢測。

迄今為止，國內(nèi)外已報道多種動物皮膚外植體模型及構(gòu)建方法，在細菌感染引起的皮膚病研究中發(fā)揮了重要的作用[11-14]，然而當前尚未有奶牛蹄部皮膚相關(guān)模型被報道。本研究擬構(gòu)建奶牛趾間皮膚外植體模型，并通過病理組織學(xué)檢查和免疫組化方法對建模效果進行評估，以期補充奶牛趾間皮膚外植體模型研究的空缺，為奶牛蹄部感染性疾病的發(fā)病機制研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

本研究所用健康牛蹄采集于當?shù)赝涝讏?；DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購于Giebco公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)購于碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、硫酸慶大霉素溶液、L-谷氨酰胺溶液購于北京索萊寶科技有限公司；免疫組化染色試劑盒、兔抗牛Caspase-3多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司；8 mm皮膚活檢打孔器購于Biopuunch公司。

1.2 試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

運輸培養(yǎng)基：每100 mL運輸培養(yǎng)基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、L-谷氨酰胺溶液1 mL、5 μg/mL硫酸慶大霉素9 μL，余量為DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基。

洗滌培養(yǎng)基：每100 mL洗滌培養(yǎng)基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、2 μg/mL硫酸慶大霉素4 μL，余量為DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基。

組織培養(yǎng)基：每100 mL洗滌培養(yǎng)基中，青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100×) 1 mL、L-谷氨酰胺溶液1 mL、5 μg/mL硫酸慶大霉素10 μL，胎牛血清10 mL，余量為以3∶1比例混合的DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.2.2樣本采集

將剛屠宰的牛蹄用清水反復(fù)沖洗表面及趾間至無污物附著，75%乙醇和2%葡萄糖鹽酸氯己定皮膚消毒劑反復(fù)清洗消毒，隨后用無菌手術(shù)刀和剪刀去除趾間皮膚毛發(fā)。更換新的無菌手術(shù)刀切除全部趾間皮膚，PBS反復(fù)沖洗后立即浸入運輸培養(yǎng)基中，冰上運輸回實驗室。

1.2.3皮膚外植體模型的構(gòu)建

使用無菌手術(shù)刀和剪刀去除趾間皮膚多余的皮下脂肪，8 mm皮膚活檢打孔器無菌收集皮膚外植體，并浸入預(yù)熱至37 ℃的洗滌培養(yǎng)基中，室溫下洗滌3次，15 min/次。

將洗滌后的皮膚外植體固定在細胞培養(yǎng)小室的內(nèi)室中(圖1)，從外室中加入2 mL組織培養(yǎng)基，并向內(nèi)室中添加組織培養(yǎng)基至外植體的表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養(yǎng)體系[15]。將外植體模型置于37 ℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h換液1次，分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48和72 h收集2塊皮膚外植體固定于4%多聚甲醛中，以0 h皮膚外植體為對照組，其余培養(yǎng)時期組織為試驗組。

圖1 奶牛趾間皮膚外植體模型組裝圖Fig.1 Assembly diagram of cow interdigital skin explant model

1.2.4病理組織切片制備及Caspase-3蛋白測定

采用動物組織石蠟切片的綠色環(huán)保制作技術(shù)[16]進行病理組織切片和蘇木素伊紅染色，觀察皮膚外植體的病理變化；運用免疫組織化學(xué)的方法檢測皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性程度及表達情況。

免疫組織化學(xué)方法主要步驟如下：將石蠟切片先后置于松節(jié)油和梯度酒精(100%、95%、90%、80%和70%)中脫蠟、脫水，隨后流水及PBS沖洗，吸水紙擦干。胰酶法修復(fù)抗原，PBS沖洗。滴加3% H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗。用非免疫性動物血清封閉后棄血清，滴加一抗(Caspase-3)，滴度為1∶300，4 ℃冰箱過夜。次日PBS沖洗后滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液孵育，PBS沖洗后滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色情況。滴加蘇木素復(fù)染細胞核，流水沖洗，烤干后封片觀察。

1.2.5細胞凋亡檢測

TUNEL細胞凋亡檢測方法主要步驟如下：石蠟切片脫蠟、脫水步驟同免疫組織化學(xué)方法。向組織切片滴加不含DNase的蛋白酶K孵育，PBS沖洗。滴加3% H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗。滴加生物素標記液避光孵育，PBS沖洗。滴加標記反應(yīng)終止液室溫孵育，PBS沖洗。滴加Streptavidin-HRP工作液室溫孵育，PBS沖洗。滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色情況。滴加蘇木素復(fù)染細胞核，流水沖洗，隨后烤干，封片觀察。

1.2.6細胞計數(shù)與統(tǒng)計分析

選取不同培養(yǎng)時期皮膚組織切片高倍視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win 64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數(shù)，并根據(jù)陽性率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%公式計算陽性率。應(yīng)用GraphPad Prism 8系統(tǒng)軟件對試驗結(jié)果進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚外植體病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果如圖2所示，對照組0 h皮膚組織的表皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰可見；真皮層的結(jié)締組織排列規(guī)則；肌層的肌纖維緊密排列，毛囊、皮脂腺及汗腺等散在分布，真皮層中可見少量的淋巴細胞(圖2(a))。與之相比試驗組各培養(yǎng)時期皮膚組織的表皮層均發(fā)生不同程度角化過度，真皮層膠原纖維紊亂并伴有不同程度中性粒細胞浸潤等病理變化，除72 h皮膚組織表現(xiàn)為中度炎癥反應(yīng)外，其余均表現(xiàn)為輕度炎癥反應(yīng)。12和24 h皮膚組織的表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，無明顯病理變化(圖2(b)和(c))；36 h皮膚組織角質(zhì)層呈網(wǎng)籃狀，偶見上皮細胞變性(圖2(d))；48 h皮膚組織可觀察到大量上皮細胞變性及少量上皮細胞壞死，同時伴隨細胞核固縮(圖2(e))；72 h皮膚組織可見表皮脫落、缺失，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官發(fā)生程度不同的壞死(圖2(f))。HE染色結(jié)果表明，皮膚外植體在培養(yǎng)24 h組織結(jié)構(gòu)完整，并未出現(xiàn)明顯病理變化；培養(yǎng)36 h出現(xiàn)細胞凋亡早期的變性跡象，提示此時已不適用于體外研究。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48及72 h皮膚外植體。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively.藍色箭頭：真皮層淋巴細胞浸潤；黑色箭頭：表皮層角化過度；紅色箭頭：毛囊、汗腺、皮脂腺壞死；綠色箭頭：細胞變性、壞死，細胞核固縮。Blue arrow: lymphocyte infiltration in the dermis; Black arrow: hyperkeratosis of the epidermis; Red arrow: hair follicle, sweat gland, sebaceous gland necrosis; Green arrows: cell degeneration, necrosis, nuclear pyknosis.

2.2 皮膚外植體TUNEL細胞凋亡檢測

TUNEL染色結(jié)果如圖3所示，對照組0 h皮膚外植體可見少量細胞發(fā)生凋亡；試驗組12、24、36、48和72 h的皮膚外植體表皮和真皮中凋亡細胞呈明顯陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中凋亡細胞數(shù)量高于真皮，組間細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，試驗組12 h皮膚外植體細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)(圖4)；24、36、48和72 h皮膚外植體細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)(圖4)。TUNEL染色結(jié)果表明，體外培養(yǎng)72 h內(nèi)的皮膚外植體凋亡細胞數(shù)量從1.72%上升至58.02%，其活性與離體培養(yǎng)時間呈正相關(guān)增長。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48 及72 h皮膚外植體。棕色為TUNEL顯色下的凋亡細胞，藍色為蘇木素染色下的細胞核。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively. Brown is TUNEL stained apoptotic cell, and blue is HE matoxylin stained nucleus.

*表示與對照組相比，各試驗組細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。* indicates that compared with the control group, the apoptosis rate of experimental groups was significantly different (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01).

2.3 皮膚外植體Caspase-3凋亡蛋白表達分析

免疫組化結(jié)果如圖5所示，對照組0 h皮膚外植體中可見輕微的Caspase-3蛋白陽性表達；試驗組12、24、36、48和72 h皮膚外植體表皮及真皮中Caspase-3蛋白明顯陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中Caspase-3蛋白陽性表達情況高于真皮，組間陽性表達率差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，試驗組12和24 h皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性率差異不顯著(P>0.05)(圖6)，無統(tǒng)計學(xué)意義；試驗組36、48和72 h皮膚外植體中Caspase-3蛋白的陽性率差異顯著(P<0.05)(圖6)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化結(jié)果表明，體外培養(yǎng)72 h內(nèi)皮膚外植體凋亡細胞數(shù)量從0.86%上升至46.96%，與TUNEL染色結(jié)果相比二者間存在一定差異，Caspase-3蛋白陽性率要低于細胞凋亡率。

(a)～(f)依次為0、12、24、36、48及72 h皮膚外植體。(a)-(f) are skin explants at 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h， respectively.黃色為DAB顯色下Caspase-3蛋白陽性表達細胞。Yellow cells with positive expression of Caspase-3 protein by DAB staining.

*表示與對照組相比，各試驗組Caspase-3蛋白陽性率差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。* indicated that compared with the control group, the positive rate of caspase-3 protein in experimental groups was significantly different (P<0.05), ** indicated extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

3.1 皮膚外植體模型效果評價

本研究通過采集屠宰場淘汰奶牛的趾間皮膚進行體外培養(yǎng)，在已有皮膚器官培養(yǎng)模型[17-18]的基礎(chǔ)上構(gòu)建外植體模型。以真實的離體皮膚組織作為研究對象，不僅符合動物實驗3R(Replacement， Reduction， Refinement)原則[9]，同時與奶牛活體試驗高昂的研究費用相比，還大幅縮減了研究成本，提高了研究的便利性，本方案無論在經(jīng)濟成本還是動物福利方面均具有較大優(yōu)勢。

HE染色表明，體外培養(yǎng)36 h皮膚外植體出現(xiàn)上皮細胞變性的跡象，而變性的細胞會發(fā)生形態(tài)學(xué)改變并伴有結(jié)構(gòu)和功能的變化，通常表現(xiàn)為細胞功能下降，甚至發(fā)展為壞死。發(fā)生變性、壞死的細胞對試驗結(jié)果會產(chǎn)生一定影響，故此時的皮膚外植體已不適用于體外研究；免疫組化結(jié)果顯示，72 h皮膚外植體Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況均保持在50%左右，活性良好，但與對照組相比，在36 h已出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)；體外培養(yǎng)24 h皮膚外植體表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，未見明顯病理變化；且Caspase-3蛋白陽性表達與細胞凋亡情況均保持在10%左右，細胞凋亡情況較弱，可用于體外研究，模型構(gòu)建成功。

3.2 皮膚外植體活性影響因素

營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣是組織細胞生長所必需的，而離體的皮膚組織缺乏供應(yīng)養(yǎng)分的血液系統(tǒng)，僅能靠吸收培養(yǎng)基中的養(yǎng)分維持生長[19]。本研究將DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基與DMEM高糖培養(yǎng)基以一定比例混合以提高培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的含量，在保證營養(yǎng)物質(zhì)豐富的基礎(chǔ)上同時還增加了營養(yǎng)成分的濃度，可滿足皮膚組織生長所需的營養(yǎng)需求；在獲取氧氣方面，將皮膚組織培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)小室中形成氣液交界面培養(yǎng)體系，使更加充足的氧氣可以滲透到組織內(nèi)部細胞。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)12和24 h皮膚外植體結(jié)構(gòu)完整、無明顯病理變化，在保持組織結(jié)構(gòu)和功能完整的同時，Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況均維持在較低的范圍內(nèi)，仍可保持較高的活性，說明本方案可滿足皮膚組織生長的營養(yǎng)需求，效果良好。

皮膚外植體直徑大小和厚度是影響其活性的另一重要因素，李新華等[19]曾在早期報道中提出皮膚組織的直徑和厚度應(yīng)在保持組織形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)上盡可能小，以避免組織中心細胞發(fā)生壞死。本研究通過查閱相關(guān)文獻將皮膚組織大小設(shè)定為 8 mm，結(jié)果表明在離體培養(yǎng)48 h皮膚外植體僅出現(xiàn)少量細胞壞死的現(xiàn)象，故推測其厚度和直徑在短期培養(yǎng)中對細胞壞死影響不大，將在接下來的研究中進一步驗證厚度和直徑對細胞壞死的影響。

3.3 細胞凋亡影響因素

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)dUTP缺口末端標記(TUNEL)法是通過識別發(fā)生斷裂DNA末端游離的3′-OH檢測細胞凋亡的免疫組化技術(shù)，因其操作簡單、應(yīng)用范圍廣泛及檢測結(jié)果靈敏等特點已成為實驗室、動物模型和臨床研究中檢測細胞凋亡的首選方法[20]。然而一些學(xué)者的研究表明TUNEL對于凋亡細胞的檢測并非是特異性的，因為它會將發(fā)生變性壞死、進行DNA修復(fù)、受到外力導(dǎo)致破壞甚至進行基因轉(zhuǎn)錄激活等細胞游離的3′-OH標記上，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性[21-22]。為保證試驗結(jié)果的準確性，本研究隨機檢測了皮膚外植體中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達情況對TUNEL染色結(jié)果加以驗證。Caspase-3蛋白是Caspase家族是介導(dǎo)細胞凋亡過程中的主要凋亡相關(guān)效應(yīng)因子，扮演著主要執(zhí)行者的身份[23-24]，對于大量蛋白質(zhì)的分裂以及凋亡過程中與凋亡相關(guān)的染色質(zhì)凝集、DNA片段化及細胞和細胞核固縮都是必需的[25]。結(jié)果表明，上述兩種方法檢測的細胞凋亡情況的確存在一定差異，并且從36 h皮膚外植體出現(xiàn)變性的細胞開始，兩者之間的差異逐漸加大，進一步證實了TUNEL法在檢測凋亡細胞中的非特異性。

4 結(jié) 論

1) 體外培養(yǎng)24 h皮膚外植體在保持組織結(jié)構(gòu)和功能完整的基礎(chǔ)上，Caspase-3蛋白陽性表達和細胞凋亡情況可維持在較低的范圍內(nèi)(10%左右)，皮膚外植體活性較高，成功構(gòu)建了一種奶牛趾間皮膚外植體模型。

2) 皮膚外植體Caspase-3蛋白和細胞凋亡情況均呈陽性表達，且隨體外培養(yǎng)時間增長成正相關(guān)性，即離體培養(yǎng)時間是影響模型活性的重要因素。