一株同步糖化發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇的尖孢 鐮刀菌的篩選

周 泉，湛佳佳,2，李 璧，張志旭，秦 丹，曾 璐*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院 醫(yī)養(yǎng)健康學(xué)院， 貴州遵義 563000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128； 4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

甘蔗是我國(guó)主要的制糖原料，由此每年會(huì)產(chǎn)生約3000萬(wàn)t的副產(chǎn)物，若將這類木質(zhì)纖維素資源合理利用，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。甘蔗渣作為一類富含纖維素、半纖維素以及大量殘?zhí)堑脑?，成為了生產(chǎn)纖維素乙醇的理想材料[2]?，F(xiàn)階段大多數(shù)的纖維素乙醇研究，都需經(jīng)過(guò)水解、糖化、發(fā)酵等多個(gè)步驟處理，工序費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不僅無(wú)法實(shí)現(xiàn)資源的充分利用，甚至因化學(xué)試劑使用過(guò)多導(dǎo)致環(huán)境污染，成本過(guò)高等問(wèn)題。如果能得到一株具備纖維素乙醇轉(zhuǎn)化能力的菌株，將多個(gè)發(fā)酵步驟置于同一個(gè)發(fā)酵體系中進(jìn)行，即采用單菌株進(jìn)行甘蔗渣纖維素的同步糖化發(fā)酵(Simultaneous Sacchrification and Fermentation，SSF)，便能很好地解決上述問(wèn)題。此外，在水解液中約有30%以木糖為代表的五碳糖難以被微生物利用，這也成為制約纖維素乙醇提高的瓶頸，因此對(duì)微生物的選擇就顯得至關(guān)重要。目前已知少數(shù)尖孢鐮刀菌菌株能夠附著在木質(zhì)纖維素底物上產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶使其降解，也有部分菌株能夠使單糖轉(zhuǎn)化生成乙醇。若能獲得一株具備纖維素降解、發(fā)酵單糖生成乙醇，同時(shí)能夠利用五碳糖的菌株材料，對(duì)于利用單菌株進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室從國(guó)內(nèi)外收集保藏的10株尖孢鐮刀菌菌株，均已完成菌種鑒定，具體信息見表1。

表1 尖孢鐮刀菌菌株信息

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；纖維素標(biāo)準(zhǔn)品：湖南國(guó)倫美生物科技有限公司；木聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

IRAきnity-1型傅里葉紅外光譜儀：日本島津公司；UV-1800型紫外可見光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA-40E型生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基配制

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉2 g，瓊脂18 g，pH值6.0，蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)皿中心打一個(gè)直徑0.5 cm的圓孔，備用。

濾紙崩解培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀2 g、硫酸銨4 g、硫酸鎂0.1 g、蛋白胨1 g和酵母膏10 g，加入蒸餾水1 L攪拌至完全溶解。每瓶50 mL分裝至250 mL三角瓶中，并加入6條1 cm×3 cm濾紙條，滅菌備用。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：甘蔗渣30 g，羧甲基纖維素鈉5 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g·L-1，硫酸鎂 0.2 g，硫酸銨3 g，蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

木糖發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖50 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 1 g、蒸餾水溶解并定容至1 L，分裝后滅菌。

甘蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基：已預(yù)處理的甘蔗渣50 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鈣1 g，加入蒸餾水1 L攪拌至完全溶解，分裝后滅菌。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株篩選

菌種初篩，參考王瑋[3]的剛果紅平板染色法，復(fù)篩參考吳慶珊[4]的濾紙片崩解法。

1.4.2 酶活力測(cè)定

接種2 mL種子液于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、 150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)，每天測(cè)定幾種主要纖維素酶的酶活。取發(fā)酵樣液5000 r·min-1離心5 min，取上清液為待測(cè)液，每株菌設(shè)3個(gè)平行。內(nèi)切葡聚糖酶（CMCA）酶活測(cè)定參照QB 2583—2003[5]附錄B的方法；外切葡聚糖酶（CBH）酶活測(cè)定參照孔芹等[6]的研究方法；β-葡聚糖酶酶活測(cè)定參照 QB/T 4481—2013的方法[7]；木聚糖酶酶活測(cè)定參照GB/T 23874—2009的方法[8]。

1.4.3 發(fā)酵五碳糖產(chǎn)乙醇性能測(cè)定

分別接種2 mL待測(cè)菌株種子液至100 mL木糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)7 d，參考馮東等[9]的生物傳感法測(cè)定乙醇含量。

1.4.4 同步糖化發(fā)酵甘蔗渣產(chǎn)乙醇性能測(cè)定

（1）發(fā)酵底物預(yù)處理。甘蔗渣原料預(yù)處理：將甘蔗渣自然風(fēng)干后粉碎，過(guò)100～200目篩，使粒徑在0.15～0.75 mm，于80 ℃烘干至恒重；底物去糖處理：參考陳楨[10]的甘油-過(guò)碳酸鈉預(yù)處理法。

（2）甘蔗渣同步糖化發(fā)酵。將5 mL新鮮種子液分別接種至經(jīng)去糖、未去糖處理的甘蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)7 d。每日跟蹤監(jiān)測(cè)殘?zhí)羌耙掖己?。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定降解率。乙醇轉(zhuǎn)化率和降解率的計(jì)算公式分別為

式中：c為乙醇濃度，g·L-1；v為酶解液的體積，L；m為甘蔗渣的質(zhì)量，kg。

式中：m1為發(fā)酵前甘蔗渣重量，g；m2為發(fā)酵后剩余甘蔗渣的重量，g。

1.5 底物成分分析

取發(fā)酵殘?jiān)?，用蒸餾水洗滌至中性，80 ℃烘干至恒重。取發(fā)酵前后的甘蔗渣樣品及纖維素、半纖維素、木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品各0.6 mg，與59.4 mg的溴化鉀粉末混勻，在研缽中充分研磨至粒徑 ≤2 μm，用傅里葉紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）在1.2 Ton壓力下作用30 s， 壓制出均勻透明無(wú)裂痕的壓片，光譜波數(shù)掃描范 圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)64次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 剛果紅平板染色初篩

剛果紅與CMC-Na反應(yīng)可生成紅色復(fù)合物，但不與降解后的單糖發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)水解圈的大小可初步判斷菌株的纖維素水解能力，水解能力越強(qiáng)，水解圈直徑越大。結(jié)果見圖1。

圖1 剛果紅平板染色結(jié)果圖

由圖1可知，各菌株均出現(xiàn)明顯的水解圈，且F1、F5、F6、F7、F8、F9和F10菌水解圈直徑均大于4.00 cm，其中F10效果最佳，達(dá)到4.5 cm。

2.1.2 濾紙崩解試驗(yàn)復(fù)篩

為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)初篩菌株F1、F5、F6、F7、F8、F9和F10進(jìn)行濾紙片崩解的復(fù)篩，結(jié)果如圖2所示。

圖2 濾紙崩解試驗(yàn)結(jié)果圖

由圖2可知，10個(gè)菌株三角瓶中的濾紙條都不同程度被降解，其中F2、F4、F6和F9菌株的降解效果不明顯，濾紙無(wú)明顯變化；F1、F5、F7菌株使濾紙邊緣輕微降解；F3、F8菌株有一定的降解效果，可使濾紙降解成小圓片；F10菌效果最明顯，可使濾紙片降解成糊狀。由此表明，F(xiàn)10菌的纖維素降解能力最佳，可用于后續(xù)試驗(yàn)的同步糖化發(fā)酵試驗(yàn) 研究。

2.2 菌株產(chǎn)酶性能

微生物酶活力大小決定著纖維素的降解效果，木質(zhì)纖維素的水解由纖維素酶和半纖維素酶起主要作用，其中，纖維素酶主要包括內(nèi)切葡萄糖酶、外切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶，半纖維素酶主要以木聚糖酶為主。如圖3所示，F(xiàn)10酶系統(tǒng)較為完全，內(nèi)切酶、外切酶、β-葡聚糖酶的酶活力分別為15.32 U·mL-1、23.56 U·mL-1、10.65 U·mL-1，與同類型的纖維素降解菌株酶活力效果類似；而F10的木聚糖酶活力值達(dá)到249.05 U·mL-1，顯著高于其他酶的活力值。

圖3 F10酶活力情況圖

2.3 發(fā)酵五碳糖產(chǎn)醇性能

木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中約有30%的五碳糖（主要由半纖維素水解而得）。而自然界中僅有少數(shù)的微生物能利用木糖生成乙醇，這也成為了纖維素乙醇產(chǎn)量高低的決定因素。本試驗(yàn)以木糖為底物，測(cè)定F10對(duì)五碳糖的產(chǎn)醇性能。結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)10菌在PDB中生長(zhǎng)狀況良好，使木糖培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯渾濁，表明F10可在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)代謝，其乙醇產(chǎn)量可達(dá)16.84 g·L-1。該試驗(yàn)結(jié)果明顯高于范金霞等[11]的研究，在纖維素轉(zhuǎn)化方面具有良好前景。由此表明F10具備良好的同步糖化發(fā)酵 潛力。?

圖4 F10不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況及發(fā)酵木糖產(chǎn)醇情況圖

2.4 尖孢鐮刀菌同步糖化發(fā)酵甘蔗渣的產(chǎn)醇性能

以甘蔗渣為底物，用F10進(jìn)行同步糖化發(fā)酵試驗(yàn)，并以去糖甘蔗渣作為對(duì)照，以驗(yàn)證在無(wú)殘?zhí)堑挠绊懴?，?duì)甘蔗渣具有同步糖化發(fā)酵的效能。如圖5所示，在未經(jīng)去糖處理的甘蔗渣中，葡萄糖起始含量為 2.89 g·L-1，呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，第2天以后趨近于0 g·L-1，但乙醇含量仍逐步增長(zhǎng)，第4天時(shí)達(dá)到峰值9.5 g·L-1，轉(zhuǎn)化率為19.0 g·kg-1，降解率可達(dá)28%，表明菌株F10對(duì)甘蔗渣的降解和糖醇轉(zhuǎn)化效果良好。此外，在無(wú)初始糖的情況下，乙醇的含量逐步增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)8.4 g·kg-1，但葡萄糖的含量卻在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均無(wú)明顯的增減變化，表明菌株F10在發(fā)酵過(guò)程中，在對(duì)甘蔗渣纖維素進(jìn)行降解的同時(shí)，將發(fā)酵體系中的單糖同步轉(zhuǎn)化生成乙醇，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了F10具備同步糖化發(fā)酵的能力。

圖5 甘蔗渣發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖和乙醇的含量變化圖

2.5 FTIR分析同步糖化發(fā)酵對(duì)甘蔗渣成分的影響

FTIR譜圖根據(jù)特征吸收峰的位置、強(qiáng)度和形狀表征化合物官能團(tuán)的振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)，不僅可用于鑒別分子結(jié)構(gòu)的歸屬還可進(jìn)行定量分析。甘蔗渣是復(fù)雜的生物質(zhì)材料，為消除多種化合物基團(tuán)相互作用的干擾，對(duì)甘蔗渣的3種主要成分纖維素、半纖維素和木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖位置、峰形進(jìn)行認(rèn)定。在 4000～400 cm-1波數(shù)段進(jìn)行FTIR掃描測(cè)定，并根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]檢索峰谷，進(jìn)行特征峰的歸屬分析，同時(shí)對(duì)發(fā)酵前后的甘蔗渣樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖6、表2所示。

圖6 甘蔗渣發(fā)酵前后的傅里葉紅外光譜圖

表2 FTIR譜圖的相關(guān)峰谷歸屬分析

甘蔗渣樣品中包含了OH、CH、C=O和C-O-C等一系列化學(xué)基團(tuán)結(jié)構(gòu)，發(fā)酵前的甘蔗渣在木質(zhì)素特征峰1582 cm-1、1417 cm-1、1125 cm-1和630 cm-1處波谷突出振動(dòng)能力強(qiáng)，而纖維素與半纖維素不明顯，根據(jù)FTIR光譜振動(dòng)強(qiáng)弱與化學(xué)標(biāo)定數(shù)據(jù)一致性可知[13]，木質(zhì)素在未發(fā)酵的甘蔗渣中占比較大。而在發(fā)酵后的樣品譜圖中，3種組分的吸收峰發(fā)生了顯著變化，木質(zhì)素的特征峰在1582 cm-1、 1417 cm-1處的振動(dòng)消失，同時(shí)630 cm-1、1130 cm-1吸收峰振動(dòng)強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明木質(zhì)素在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中苯環(huán)骨架的C=O、C-H面內(nèi)彎曲發(fā)生了氧化裂解，OH面外彎曲，C—O—C伸縮結(jié)構(gòu)減少，表明木質(zhì)素在發(fā)酵后含量降低。而發(fā)酵后出現(xiàn)振動(dòng)增強(qiáng)的吸收峰歸結(jié)為半纖維素C—O伸縮、C=O不對(duì)稱彎曲和C=O伸縮振動(dòng)，以及以1047 cm-1、 1730 cm-1、1630 cm-1為半纖維素特征的吸收峰增多。3種組分發(fā)酵前后的變化趨勢(shì)表明，甘蔗渣中的木質(zhì)素在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中被大量降解但仍有一定殘留，推測(cè)F10在同步糖化發(fā)酵的過(guò)程中，對(duì)木質(zhì)素有較好的降解優(yōu)勢(shì)，與木質(zhì)素形成的高分子抗性屏障被解聚后，纖維素和半纖維素的空間結(jié)構(gòu)暴露出來(lái)，為菌株的同步糖化發(fā)酵提供了良好的底物條件。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)剛果紅染色、濾紙片崩解試驗(yàn)篩選獲得一株具有較強(qiáng)纖維素水解能力菌株FOCmh2-2，水解圈直徑達(dá)到4.5 cm，可使濾紙完全水解成糊狀。其纖維素酶系統(tǒng)完全，酶活力良好，具備良好的五碳糖轉(zhuǎn)化能力。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各纖維素酶與乙醇的生成量呈正相關(guān)增長(zhǎng)，其中木聚糖酶的酶活最高，達(dá)到249.05 U·mL-1，可使半纖維素快速水解為五碳糖，且FOC-mh2-2能代謝普通菌株無(wú)法利用的五碳糖，可使純木糖的產(chǎn)醇量達(dá)16.84 g·L-1。 且能在底物殘?zhí)墙鯙?的條件下進(jìn)行木質(zhì)纖維素發(fā)酵，具備同步糖化發(fā)酵效能。經(jīng)FTIR分析，在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)素在發(fā)酵后含量降低，推測(cè)菌株在發(fā)酵過(guò)程中使木質(zhì)素降解，改變了原料難以利用的特殊結(jié)構(gòu)，使發(fā)酵快速進(jìn)行。本試驗(yàn)篩選所得菌株FOC-mh2-2可同步實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效水解與糖化，可作為“一步法”乙醇發(fā)酵工藝的改良野生型菌株，為纖維素乙醇生產(chǎn)降低成本、提質(zhì)、增效提供參考。