食品中菌落總數(shù)檢測方法的比較研究

謝范英

（寧德市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，福建寧德 352100）

菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)[1]。它是食品衛(wèi)生檢驗中最常見的微生物檢測項目，常被用作判定食品生產(chǎn)的衛(wèi)生質(zhì)量和食品被微生物污染的程度[2-4]。

目前，國內(nèi)食品中菌落總數(shù)檢測的方法主要是GB 4789.2—2016中的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法（Standard Plate Count，SPC），但該方法的實驗步驟較為煩瑣，檢測時間相對較長，且準(zhǔn)確性易受培養(yǎng)基質(zhì)量、配制水平及實驗人員差異等的影響。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，為滿足快速檢測市場的需求，越來越多食品微生物快速測定方法和產(chǎn)品被研究開發(fā)出來，菌落總數(shù)測試片是其中一種快速檢測產(chǎn)品[4-6]。國外有不少學(xué)者采用菌落總數(shù)測試片法（Easy Plate，EP）代替平板法，部分檢測機(jī)構(gòu)如加拿大食藥局的MFHPB-33-2001采用3M菌落測試片對食品和食品配料中的菌落總數(shù)進(jìn)行測定，美國官方分析化學(xué)師協(xié)會（Association of Oきcial Agricultural Chemists，AOAC）官方方法989.10用EP對乳制品中的菌落總數(shù)進(jìn)行測定[7-9]。而國內(nèi)的GB 4789.2—2022也增加了使用菌落測試片檢測菌落總數(shù)的內(nèi)容。雖然國內(nèi)市場上使用較多的是美國3M、日本NISSUI等進(jìn)口的菌落總數(shù)測試片，但近年來隨著我國越來越重視食品安全，國內(nèi)越來越來越多的生物公司致力于研發(fā)相關(guān)的食品安全檢測產(chǎn)品，為食品檢測機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)提供了更多的選擇。

本文選擇3株標(biāo)準(zhǔn)菌株[大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63303]作為質(zhì)控菌株，采用國內(nèi)外兩種菌落總數(shù)測試片和SPC分別對6類食品進(jìn)行菌落測定，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，為食品檢測機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)選擇合適的檢測產(chǎn)品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與菌株

市場和超市隨機(jī)購買6類食品，共60批，分別為糕點(diǎn)10批、水產(chǎn)制品10批、肉制品10批、調(diào)味品10批、方便食品10批以及膨化食品10批；標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63303。

1.2 儀器與試劑

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋，210428）；3M PetrifilmTM6406菌落總數(shù)測試片（美國3M公司，33HRJ5/33JLE3）；MicroFast?AC菌落總數(shù)測試片（美正生物，20220422）；腦心浸液肉湯（北京陸橋，210118）。

生物安全柜（上海力申，Hfsafe-1500E）；高壓滅菌鍋（日本TOMY，F(xiàn)LS-1000）；拍擊式均質(zhì)器（iMiX公司，LC10063038）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，DHP-9272）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液的制備

分別從大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923和蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63303的磁珠保藏管中挑取磁珠于腦心浸液肉湯中，在 36 ℃下培養(yǎng)24 h得到菌懸液，用生理鹽水稀釋至合適的濃度。

1.3.2 培養(yǎng)基制備與樣液制備

平板計數(shù)瓊脂按照北京陸橋產(chǎn)品的使用說明進(jìn)行配制；食品樣液依據(jù)GB 4789.2—2016進(jìn)行處理。

1.3.3 SPC試驗和EP試驗

SPC操作過程依據(jù)GB 4789.2—2016進(jìn)行；EP試驗依據(jù)相關(guān)產(chǎn)品的使用說明進(jìn)行操作[3M菌落總數(shù)測試片培養(yǎng)（48±3）h，MicroFast?AC菌落總數(shù)測試片培養(yǎng)24～48 h]。

1.3.4 統(tǒng)計分析方法

將測試所得數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗確定EP和SPC檢測結(jié)果的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05時表示有統(tǒng)計學(xué)意義，即差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落辨識度

金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌及蠟樣芽孢桿菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1～圖3所示。金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌在平板計數(shù)瓊脂上均呈白色點(diǎn)狀，金黃色葡萄球菌所形成的菌落更??；金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌在3M菌落總數(shù)測試片和MicroFast?AC菌落總數(shù)測試片均形成紅色邊緣清晰的點(diǎn)狀菌落。而蠟樣芽孢桿菌在平板計數(shù)瓊脂上的菌落形態(tài)，部分是圓形或近圓形的白色菌落，部分則是不規(guī)則的、邊緣不整齊的，甚至有向外延伸趨勢的菌落；在3M菌落總數(shù)測試片上形成了紅色圓形、邊緣稍模糊的菌落；在MicroFast?AC菌落總數(shù)測試片上形成的紅色菌落邊緣模糊、不規(guī)則，有的甚至有很長的拖尾。

圖1 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 SPC和EP檢測結(jié)果與分析

60批 樣 品 分 別 采 用SPC、3M測 試 片 和MicroFast?AC測試片進(jìn)行菌落總數(shù)的測定，對測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3M測試片與SPC測定的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計處理得到tAB=0.145，PAB=0.885，PAB＞0.05， 表明這兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異；MicroFast?AC測試片與SPC測定的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計處理得到tAC=0.202，PAC=0.840，PAC＞0.05，表明這兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異。

對6類樣品中的每一類樣品用上述3種方法檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表1。對于每一類別樣品，3M測試片、MicroFast?AC測試片與SPC測定的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計處理，均得到P＞0.05，這6類樣品采用兩種測試片與SPC測定結(jié)果均無顯著性差異。

2.3 SPC和EP檢測菌落總數(shù)的各項指標(biāo)比較

SPC、3M測試片和MicroFast?AC測試片檢測菌落總數(shù)的各項指標(biāo)比較如表2所示。對于簡便性和工作量，SPC前期需配制培養(yǎng)基、滅菌等準(zhǔn)備程序，后期還要清洗，且實驗步驟較為煩瑣，操作時間相對較長，增加了工作量；而EP由于其培養(yǎng)基系統(tǒng)是預(yù)先制備好的，省去了大量煩瑣的準(zhǔn)備工作，且操作更為簡便，增加了實驗的效率；但3M測試片在檢測時需要壓板摁壓，MicroFast?AC測試片則不需要，因此操作起來更為簡便。對于培養(yǎng)時間和空間，雖然3種方法都需要培養(yǎng)48 h，但EP培養(yǎng)時所需的空間小，相對于SPC大大節(jié)約了空間成本。對于計數(shù)的準(zhǔn)確性，SPC在檢測如糕點(diǎn)等樣品時，常因為有些菌會蔓延而無法準(zhǔn)確計數(shù)，而EP能夠抑制菌落的蔓延，且菌落呈現(xiàn)紅色，更易于判讀和計數(shù)；3M測試片在菌落辨識度上明顯優(yōu)于MicroFast?AC測試片。對于檢測成本，EP的成本比SPC高出很多，兩種測試片的成本相差不大。

表1 3種檢測方法對不同類別樣品菌落計數(shù)結(jié)果的比較分析

表2 3種檢測方法檢測菌落總數(shù)的各項指標(biāo)比較

3 結(jié)論與討論

①3M測試片在菌落辨識度上優(yōu)于MicroFast?AC測試片和平板計數(shù)瓊脂，對于復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測，結(jié)果更易于判讀和計數(shù)。②采用3M測試片和MicroFast?AC測試片測得的結(jié)果與SPC測得的結(jié)果無顯著差異。③EP在簡便性、工作量及檢測空間等方面要優(yōu)于SPC，但是檢測成本也較高。

雖然EP的成本比SPC高出很多，但EP的檢測結(jié)果與SPC無顯著差異，且EP可以省去很多繁雜的前期準(zhǔn)備工作和后期清理工作，操作更簡便，可節(jié)省大量的培養(yǎng)空間，對于短期大批量的微生物檢測工作，EP具有明顯優(yōu)勢。食品檢測機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)可考慮操作簡便性、檢測空間、成本及檢驗結(jié)果的判讀等多方面因素，選擇合適的檢測 方法。