克氏原螯蝦白斑綜合征病毒研究進(jìn)展

程保政，王順昌

(1.淮南市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，安徽 淮南 232007；2.淮南師范學(xué)院，安徽 淮南 232038)

自2003 年以來，我國(guó)已經(jīng)成為世界頭號(hào)克氏原螯蝦生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，各類病害的傳播速度也迅速增加，“五月瘟”等暴發(fā)性疾病的發(fā)生給主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來很大威脅(Shen G 等，2020)?？耸显r的主要病原體包括螺原體、弧菌、嗜水氣單胞菌、假單胞菌、真菌和白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)等，其中WSSV 因具有傳播速度快、死亡率高和防治困難等特點(diǎn)，給克氏原螯蝦等甲殼類養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失。

一、WSSV的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)特征

1.WSSV 的發(fā)現(xiàn) 1992 年，白斑綜合征病毒首次發(fā)現(xiàn)于我國(guó)臺(tái)灣省對(duì)蝦池內(nèi)，造成大規(guī)模對(duì)蝦死亡(Chou H Y 等，1995)；1993 年由井上等人從暴發(fā)疾病的對(duì)蝦體內(nèi)觀察到病毒顆粒，1993年5月至8 月，我國(guó)從南向北陸續(xù)暴發(fā)對(duì)蝦白斑綜合征，導(dǎo)致我國(guó)對(duì)蝦減產(chǎn)80%(Zhan W B 等，1998)，到2005 年，對(duì)蝦白斑綜合征已經(jīng)擴(kuò)散至全球主要養(yǎng)殖國(guó)家，1996 年，該病毒被命名為白斑綜合征病毒(Escobedo-Bonilla C M 等，2008)。WSSV 發(fā)現(xiàn)于對(duì)蝦科(Penaeid)蝦類，但很快擴(kuò)散至其他養(yǎng)殖甲殼類動(dòng)物，如蟹、螯蝦等，到2002 年，WSSV 已經(jīng)廣布于養(yǎng)殖和天然水域眾多甲殼類動(dòng)物體內(nèi)。由于WSSV 幾乎可以感染所有的養(yǎng)殖甲殼類，已經(jīng)成為對(duì)全球蝦蟹類養(yǎng)殖威脅最嚴(yán)重的病毒(Shekhar M S等，2015)。

2.WSSV 的分子特征 WSSV 是一種無包涵體的桿狀包膜病毒，長(zhǎng)210～380 納米、寬70～167 納米，屬于大型無脊椎動(dòng)物病毒。WSSV為雙鏈DNA病毒，基因組大小約300 kb。目前，已經(jīng)測(cè)定了多個(gè)病毒株的基因組全序列，如中國(guó)大陸株、中國(guó)臺(tái)灣株、泰國(guó)株和澳大利亞株等。WSSV 基因組編碼約184 個(gè)蛋白，但目前只有約30%的編碼蛋白的功能得到了注釋。在已經(jīng)注釋的38 種WSSV 結(jié)構(gòu)蛋白中，有21 種位于被膜、10 種位于核衣殼、5 種位于衣殼外被(Escobedo- Bonilla C M 等，2008)?；铙w實(shí)驗(yàn)顯示，位于外被的VP28蛋白與病毒的入侵密切相關(guān)，利用VP28 多克隆抗血清處理可以顯著降低死亡率。克氏原螯蝦實(shí)驗(yàn)顯示，包膜蛋白VP31、VP33 和衣殼外被蛋白VP36A 中和抗體能夠顯著降低機(jī)體的感染率，發(fā)揮保護(hù)作用，這一結(jié)果顯示，WSSV 的結(jié)構(gòu)蛋白可以作為重要的免疫靶標(biāo)(van Hulten等，2001)。

二、WSSV的檢測(cè)、病理學(xué)特征和傳播

1.WSSV 的檢測(cè)方法 迄今為止，已經(jīng)有多種檢測(cè)方法應(yīng)用于各類研究，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、原位雜交、透射電鏡觀察、套式PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)于2012 年提出了白斑綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第1部分：核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)法》(GB/T 28630.1-2012)、《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第2 部分：套式PCR 檢測(cè)法》(GB/T 28630.2-2012)、《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第3 部分：原位雜交檢測(cè)法》(GB/T 28630.3-2012)、《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4 部分：組織病理學(xué)診斷法》(GB/T 28630.4-2012)和《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第5 部分：新鮮組織的T-E 染色法》(GB/T 28630.5-2012)等，其中套式PCR法靈敏度高、成本低廉，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的監(jiān)測(cè)方法。

2.WSSV感染的病理學(xué)特征 利用套式PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WSSV 廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)器官，如體表、附肢、肝胰臟、鰓和血淋巴等(Escobedo-Bonilla C M 等，2008)。在外觀癥狀上，感染W(wǎng)SSV 的對(duì)蝦均在外殼顯現(xiàn)出直徑0.5～3.0 毫米的白色斑點(diǎn)，但目前斑點(diǎn)形成的確切機(jī)制尚不清楚，Wang Y G 等(1999)推測(cè)WSSV 感染損傷了外表皮，導(dǎo)致鈣離子在甲殼內(nèi)沉積，從而形成白色斑點(diǎn)。克氏原螯蝦感染病毒后甲殼并不呈現(xiàn)出白色斑點(diǎn)，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，感染W(wǎng)SSV 的克氏原螯蝦呈現(xiàn)出肝細(xì)胞、鰓細(xì)胞腫大和壞死等病理學(xué)特征。蘇木精伊紅染色顯示，感染W(wǎng)SSV 的細(xì)胞核膨大和染色質(zhì)邊緣化，并具有典型的伊紅染色深的包涵體(何琦瑤等，2018)。流行病調(diào)查顯示，感染W(wǎng)SSV 的克氏原螯蝦活力下降、反應(yīng)遲鈍、攝食率顯著降低，常常靜臥于池邊；解剖研究發(fā)現(xiàn)，患病特別是瀕死個(gè)體肝胰臟褪色、表皮腫脹而易與甲殼分離、血淋巴凝固能力下降等(Shi Z 等，2005)；腸道菌群分析顯示，感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦腸道氣單胞菌屬、黃桿菌屬等潛在致病菌豐度顯著增加，這也可能是導(dǎo)致蝦死亡的重要原因(陳一銘等，2020)。

3.國(guó)內(nèi)WSSV流行情況 2006年WSSV首次暴發(fā)于浙江舟山養(yǎng)殖的克氏原螯蝦(王忠發(fā)等，2007)，自此以后，WSSV便在我國(guó)克氏原螯蝦主養(yǎng)區(qū)流行，并成為主要的死亡因素。根據(jù)潘子豪(2013)報(bào)道，安徽省自2008 年以來，多地發(fā)生克氏原螯蝦規(guī)模性死亡，經(jīng)巢式PCR分析鑒定，該疾病的病原體為WSSV。湖北省是我國(guó)最大的克氏原螯蝦產(chǎn)區(qū)，也是克氏原螯蝦WSSV 的高發(fā)地區(qū)，WSSV 陽性檢出率在40%～65%，這一發(fā)病率與國(guó)外報(bào)道的發(fā)病率基本一致(李青彬等，2019)。陳紅蓮等(2020)采樣分析發(fā)現(xiàn)，在安徽省克氏原螯蝦主養(yǎng)區(qū)，稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦WSSV 的檢出率高達(dá)98.3%，但天然水域檢出率不到10%，表明高密度養(yǎng)殖是造成WSSV 傳播的重要因素。到目前為止，國(guó)內(nèi)所有克氏原螯蝦主養(yǎng)區(qū)均存在WSSV 的流行和傳播，天然水域WSSV 檢出率也逐漸提高，并且可能存在與其他病毒交互作用等情況。

三、機(jī)體免疫系統(tǒng)和環(huán)境因素的影響

1.免疫系統(tǒng)對(duì)WSSV 感染的反應(yīng) 克氏原螯蝦對(duì)病原體的反應(yīng)來自于先天免疫機(jī)制，從構(gòu)成上看，克氏原螯蝦先天免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)部分，其中細(xì)胞免疫依賴于血細(xì)胞識(shí)別和吞噬病原體，體液免疫主要依賴于酚氧化酶和凝集素系統(tǒng)等(Huang Y等，2020)。酚氧化酶是甲殼類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過黑化反應(yīng)抵抗病原體侵襲。利用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV 后，肝胰臟和血細(xì)胞酚氧化酶的表達(dá)顯著上調(diào)(Yi S等，2017)。

2.克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV 的信號(hào)傳遞 機(jī)體對(duì)病原體的反應(yīng)依賴于一系列保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，目前的研究發(fā)現(xiàn)，Toll 途徑、JAK-STAT 途徑和PI3K-AKT 途徑等在克氏原螯蝦應(yīng)答WSSV 感染中具有重要功能(Liu L K等，2021)。Toll信號(hào)途徑是無脊椎動(dòng)物的關(guān)鍵免疫反應(yīng)分子，到目前為止，已經(jīng)在克氏原螯蝦鑒定出4 個(gè)Toll 受體，其中PcToll5 和PcToll6 參與調(diào)控抗脂多糖因子(ALF)的表達(dá)，而感染W(wǎng)SSV 后，克氏原螯蝦PcALF2 和PcALF3 顯著上調(diào)，并具有顯著的時(shí)間效應(yīng)，參與了機(jī)體對(duì)WSSV 的防御機(jī)制(Huang Y 等，2018)。JAK-STAT途徑在進(jìn)化上高度保守，參與了脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的抗病毒反應(yīng)。已經(jīng)鑒定出克氏原螯蝦的3 個(gè)JAK-STAT 基因，在WSSV 感染時(shí)，呈現(xiàn)出顯著的差異性表達(dá)。Chen H 等(2021)對(duì)感染W(wǎng)SSV 3 小時(shí)的克氏原螯蝦腸道轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，共篩選出7 000 個(gè)差分表達(dá)基因，可歸屬為250 個(gè)KEGG 通路，其中有28 個(gè)通路具有極其顯著性差異表達(dá)(P＜0.01)，利用qRT-PCR 對(duì)JAK-STAT途徑定量分析發(fā)現(xiàn)，其中21 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)、2 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。利用基于iTRAQ 技術(shù)的蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，感染W(wǎng)SSV 后，克氏原螯蝦血細(xì)胞與吞噬作用、細(xì)胞凋亡以及一系列蛋白酶的活性顯著上調(diào)(Zhou X等，2021)。

3.養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)WSSV 的影響 WSSV 的暴發(fā)是病毒、宿主和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，養(yǎng)殖水溫是最重要的環(huán)境因子。藍(lán)海琴等(2021)通過采集不同地區(qū)和不同季節(jié)的克氏原螯蝦樣本分析發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦WSSV 檢出率極低，在水溫20～26℃下，WSSV 陽性率達(dá)60%以上，當(dāng)水溫升高至26℃以上時(shí)，WSSV 的檢出率顯著降低。人工感染實(shí)驗(yàn)顯示，在19℃水溫下時(shí)，克氏原螯蝦死亡率為(23.51±0.84)%，當(dāng)水溫升高至25℃時(shí)，感染后死亡率達(dá)到100%，但當(dāng)水溫升高至32℃時(shí)，感染后死亡率降低至(38.42±1.21)%。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，低溫不利于WSSV 的增殖，而高溫有助于激活機(jī)體的先天免疫分子，如抗菌蛋白2、酚氧化酶和熱休克蛋白70等(Jiang N等，2019)。由此可見，養(yǎng)殖水溫對(duì)WSSV 的傳播、致死率等有著關(guān)鍵的影響。阿特拉津是常用除草劑，同時(shí)也是潛在的內(nèi)分泌干擾物，阿特拉津暴露可導(dǎo)致克氏原螯蝦總血細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性等先天免疫參數(shù)顯著下降，增加了感染W(wǎng)SSV 的死亡率(Yang H 等，2021)。此外，一些研究顯示，環(huán)境高水平氨氮、亞硝酸氮等均可加速感染W(wǎng)SSV 的克氏原螯蝦死亡，而在弱堿性環(huán)境條件下，WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)的增殖速率最低(郝晨光，2020)。由此可見，在當(dāng)前缺乏有效藥物進(jìn)行防治的條件下，改善養(yǎng)殖環(huán)境是應(yīng)對(duì)WSSV 感染的有效手段。

四、克氏原螯蝦WSSV防治技術(shù)研究

2005年，武漢大學(xué)基于WSSV包膜蛋白VP28和VP19 開發(fā)的多克隆抗體，在15～22℃下，對(duì)感染病毒的克氏原螯蝦保護(hù)率可達(dá)100%，在26℃下，對(duì)感染的保護(hù)率達(dá)到65%(袁軍法等，2005)。以50毫克/千克比例在飼料中添加阿昔洛韋，可有效抑制WSSV 的復(fù)制，克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV 后的成活率提高至56%(Liang C S 等，2021)。目前對(duì)于克氏原螯蝦WSSV 的防治研究多集中在如何激發(fā)機(jī)體先天免疫系統(tǒng)活性，從而使機(jī)體獲得抵抗WSSV 的能力。人們使用了各類免疫佐劑、免疫增效劑、天然產(chǎn)物、微生物制劑等，均取得一定效果。橙皮素是存在于柑橘屬植物幼果中的天然黃酮類化合物，Qian X等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，以50毫克/千克劑量添加于餌料中，可有效降低人工感染W(wǎng)SSV 后的死亡率，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素顯著上調(diào)了總血細(xì)胞計(jì)數(shù)、酚氧化酶和超氧化物歧化酶3個(gè)關(guān)鍵先天免疫參數(shù)的活性。利用微生物的拮抗作用，可降低WSSV感染的死亡率，Lai Y等(2020)在飼料中添加5 克/千克的解淀粉芽孢桿菌飼喂克氏原螯蝦，在感染W(wǎng)SSV 168小時(shí)后，依然有超過40%個(gè)體存活，而對(duì)照組在感染156 小時(shí)后就全部死亡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌飼料補(bǔ)充增加了Toll 受體、NF-κB 和C 型凝集素等關(guān)鍵先天免疫分子的表達(dá)。研究顯示，通過飼料補(bǔ)充殼聚糖、紫云英多糖或殼寡糖等，均可顯著提高克氏原螯蝦的先天免疫能力，增強(qiáng)其對(duì)白斑病毒等病原體的抵抗力(Cheng Y，2019)。

這些結(jié)果顯示，在飼料中添加免疫增強(qiáng)劑或微生態(tài)制劑，為防治WSSV 提供了新思路，但至目前尚沒有篩選出任何低成本有效治療藥物，也沒有選育出抗WSSV 克氏原螯蝦新品種。因此，在生產(chǎn)上，除了改善養(yǎng)殖環(huán)境、合理調(diào)配養(yǎng)殖季節(jié)與上市時(shí)間等措施外，尚缺乏根本性的有效手段。