不同濃度氮處理毛竹水通道蛋白基因表達模式及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

朱成磊 林澤銘 李天闊 高志民

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京竹藤科學(xué)與技術(shù)重點開放實驗室 北京 100102)

氮是影響植物生長的重要營養(yǎng)元素，水分平衡是植物生長不可或缺的基礎(chǔ)條件。植物體內(nèi)水和氮運輸之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，從蒸騰驅(qū)動的土壤中的物質(zhì)流動，到通過膜轉(zhuǎn)運器和通道被根系吸收并運輸?shù)降厣掀鞴伲婕八终{(diào)節(jié)和氮運輸?shù)男盘柤壜?lián)、根系構(gòu)型和栓化的疏水根屏障、質(zhì)外體水和氮向維管系統(tǒng)遷移控制等許多方面。植物對氮等大量營養(yǎng)元素的可利用性在很大程度上受土壤中可供水量的調(diào)節(jié)，在干旱時植物生長同時受水和氮的限制[1]。土壤氮添加能夠增加葉片和葉肉細胞厚度、單位葉面積細胞間隙暴露的葉肉表面積和氣孔開放狀態(tài)，提高葉片氮含量、水通道蛋白(AQP)和碳酸酐酶活性，顯著促進葉肉和氣孔導(dǎo)度的增加[2]。研究顯示，當(dāng)大麥(Hordeumvulgare)葉片中氮含量減少時，AQP基因(HvTIPs)表達上調(diào)，表明它們參與了氨和尿素的液泡卸載[3]；氮的吸收和同化同時發(fā)生在單穗果子蔓鳳梨(Guzmaniamonostachia)的單個葉片中，在葉基部通過脲酶和硝酸還原酶吸收氮和生產(chǎn)銨，硝酸鹽和銨的高親和轉(zhuǎn)運蛋白(NRT2.5和AMT1.2)、尿素轉(zhuǎn)運蛋白(DUR3)和水通道蛋白(TIP2.1)基因上調(diào)，而在葉尖中硝酸鹽和銨的低親和轉(zhuǎn)運蛋白(NRT1.2和AMT3.1)、水通道蛋白(PIP1.2)基因呈高表達[4]。由此表明，在植物生長中氮轉(zhuǎn)運蛋白基因和水通道蛋白基因的表達存在密切的關(guān)聯(lián)性。

水和氮對作物生產(chǎn)力的影響超過了其他大多數(shù)環(huán)境因子[1]。在全球氣候變化日趨明顯的背景下，植物獲取充分的氮素營養(yǎng)并維持細胞水分平衡，是維持植物正常生長的關(guān)鍵。研究表明，植物AQP能夠促進尿素通過膜的擴散，如高大鸚哥鳳梨(Vrieseagigantea)的VgTIP2；1除了運輸水外還能運輸尿素，而VgPIP1；2可能促進銨/氨的擴散[5]。竹子具有生長速度快、材質(zhì)優(yōu)良和適應(yīng)范圍廣的突出特點，通過施肥可以實現(xiàn)竹子的高產(chǎn)。目前，對竹子中氮吸收、運轉(zhuǎn)的基因[6-8]和水通道蛋白基因[9-10]雖然已有一些報道，但對于在氮添加處理下AQP基因的表達模式以及氮運轉(zhuǎn)蛋白和AQP基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚未見報道。本研究利用前期項目組獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對不同氮濃度處理下毛竹(Phyllostachysedulis)AQP基因的表達模式進行分析，針對差異表達AQP基因分析其啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件，進一步鑒定差異表達的轉(zhuǎn)錄因子(TF)，構(gòu)建差異表達AQP基因和TF的共表達網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵的基因，并用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證，以期為后續(xù)開展基因功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取在人工氣候室[光周期為16 h光/8 h暗、光照強度為300 μmol/(m2·s)、溫度為28 ℃、濕度為60%]培養(yǎng)2個月左右、且生長狀態(tài)一致的毛竹幼苗用于實驗，將其根部清洗干凈，然后放入含有不同濃度KNO3(N0=0 mmol/L，N6=6 mmol/L，N18=18 mmol/L)的改性木村B溶液中培養(yǎng)2周[8,11]。隨后采收幼苗根系，經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃下保存。每個氮處理組包含3個生物重復(fù)。利用試劑盒從9個樣本中提取總RNA，進行轉(zhuǎn)錄組和小RNA測序。所有小RNA和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)序列已存入NCBI數(shù)據(jù)庫(SRA)，項目編號為PRJNA797724 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA797724)(SRR17650178—SRR17650186)和PRJNA797734 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA797734)(SRR17635191—SRR17635199)[8]。

1.2 差異表達基因篩選和啟動子元件分析

為了鑒定N0、N6和N18處理之間的差異基因，利用DESeq2_EBSeq軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的差異基因(DEGs)進行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change (|FC|)≥1.5和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05的DEGs?；谵D(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測網(wǎng)站(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)[12]，以水稻(Oryzasativa)為參考物種，篩選標(biāo)準(zhǔn)閾值p≤e-4、q≤0.05，對PeAQPs的1 000 bp啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合元件進行篩查。

1.3 相關(guān)性分析和共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)PeAQPs和TFs在氮處理條件下的表達模式，利用基迪奧在線分析平臺(https://www.omicshare.com/tools/home/report/reporticabg.html)，基于皮爾森相關(guān)系數(shù)(PCC)對PeAQPs和TFs間的相關(guān)性進行分析，篩選條件為：|cor|≥0.9和P≤0.05。利用Cytoscape (v.3.7.1)軟件構(gòu)建TFs和PeAQPs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進行可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氮處理下PeAQPs的表達

利用不同濃度氮處理的毛竹根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定到30個差異表達的PeAQPs，包括14個PePIPs、8個PeTIPs、7個PeNIPs和1個PeSIP2-1，分別占各亞家族成員的66.7%、42.1%、50.0%和33.3%(圖1A)。這些PeAQPs在不同濃度氮條件下表現(xiàn)出不同的表達模式，主要分為2類。第1類，隨著氮濃度的提高，基因上調(diào)表達；第2類，隨著氮濃度的提高，基因下調(diào)表達(圖1B)。在PePIPs亞家族的14個基因中，PePIP2-3、PePIP1-6、PePIP2-2、PePIP2-4、PePIP2-13、PePIP2-14和PePIP2-15為第1類，且PePIP2-3的表達量隨著氮濃度提高而上升，其余6個基因表達量為先上升后下降，但N18組仍然高于N0組；而PePIP1-2、PePIP1-3、PePIP1-4、PePIP2-6、PePIP2-8、PePIP2-11和PePIP2-12為第2類。在PeTIPs亞家族的8個差異表達基因中，PeTIP1-2、PeTIP4-2和PeTIP4-3為第1類，且PeTIP4-2的表達量隨著氮濃度提高而上升，PeTIP1-2和PeTIP4-3表達量為先上升后下降；PeTIP1-1、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3和PeTIP2-4為第2類。在PeNIPs亞家族的7個差異表達基因中，PeNIP1-1和PeNIP1-2為第1類；PeNIP1-3、PeNIP1-5、PeNIP2-2、PeNIP2-4和PeNIP3-3為第2類。PeSIP2-1基因的表達模式為第2類，隨著氮濃度的提高，基因持續(xù)下調(diào)表達。

注：A：基因表達數(shù)量；B：基因表達譜。圖1 PeAQPs在氮處理下的表達分析Fig.1 Expression analysis of PeAQPs under nitrogen treatments

2.2 PeAQPs啟動子的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件

為探究上述30個差異表達PeAQPs的調(diào)控機制，對基因啟動子中的TF調(diào)控元件進行分析。結(jié)果表明，在這些PeAQPs上游啟動子的1 000 bp序列中，除了4個基因(PeNIP1-5、PeTIP2-3、PeTIP2-4和PeTIP4-2)啟動子中未鑒定到TF調(diào)控元件外，其余26個PeAQPs啟動子中共鑒定出14種TF調(diào)控元件(圖2)。其中Dof轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在PeAQPs的啟動子中分布最廣，在20個基因啟動子中均鑒定到，包括11個PePIPs、5個PeNIPs和4個PeTIPs。其中PeNIP1-1和PeTIP4-1擁有最多的Dof結(jié)合元件，分別為12個和10個，其他基因啟動子中均擁有1～9個Dof的結(jié)合位點。BBR-BPC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在PeAQPs的啟動子中分布最多，在12個基因(6個PePIPs、4個PeNIPs和2個PeTIPs)啟動子中共鑒定出117個結(jié)合位點，其中PePIP2-6、PePIP1-6和PeNIP1-3擁有最多的BBR-BPC結(jié)合元件，分別為35個、20個和23個，其他基因啟動子中均擁有1～9個BBR-BPC的結(jié)合位點(圖2A)。在5個PeAQPs的啟動子中鑒定出C2H2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件，其中PeTIP2-2啟動子中含有9個該元件。另外，在這些基因啟動子中還鑒定出bZIP、ERF、GATA、B3、MICK-MADS、MYB-Related、NAC、SBP、HSF、HD-ZIP和AP2等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件(圖2B)。

注：A：高峰度TF結(jié)合元件；B：低峰度TF結(jié)合元件。圖2 PeAQPs啟動子中的TF結(jié)合元件數(shù)量統(tǒng)計Fig.2 Statistics of the number of TF binding elements in the promoters of PeAQPs

在PePIPs亞家族中，PePIP1-6的啟動子鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件最多，包括20個BBR-BPC元件、4個bZIP元件、4個MICK-MADS元件和2個Dof元件，以及2個HSF元件。另外，在PePIP2-6啟動子中，除了發(fā)現(xiàn)35個BBR-BPC元件外，還有3個C2H2元件以及1個Dof元件。在PePIP1-2、PePIP2-3、PePIP2-11和PePIP2-13啟動子中均只鑒定到1種TF元件，分別為4個BBR-BPC元件、3個Dof元件、1個ERF元件和4個B3元件。在其余8個PePIPs的啟動子中，均存在2～4種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件。在PeTIPs亞家族中，PeTIP1-2的啟動子中鑒定出4種TF元件，包括6個ERF元件、3個Dof元件、1個GATA元件和1個C2H2元件。在PeTIP2-1、PeTIP2-2和PeTIP4-1啟動子中也鑒定到Dof元件。而BBR-BPC元件在PeTIPs啟動子中分布并不廣泛，只在PeTIP1-1和PeTIP2-2中鑒定到6個和8個，在PeTIP1-1中還鑒定到NAC元件和B3元件。在PeTIP4-1的啟動子中只鑒定到10個Dof元件。在PeNIPs亞家族中，Dof元件和BBR-BPC元件的分布較多，在5個PeNIPs啟動子存在Dof元件，4個PeNIPs啟動子中存在BBR-BPC元件。其中PeNIP1-3啟動子中鑒定到23個BBR-BPC元件、4個ERF元件、1個MICK-MADS元件和1個C2H2元件，而PeNIP1-1的啟動子中只鑒定到12個Dof元件。PeNIP2-4中不僅含有5個Dof元件和1個BBR-BPC元件外，還有1個HD-ZIP元件。這些結(jié)果表明，PeAQPs不同亞家族成員含有的元件種類和數(shù)量都不盡相同，表明它們的表達可能受到不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，表達的差異進而導(dǎo)致功能方面的不同。

2.3 差異表達TF的篩選和PeAQPs的共表達網(wǎng)絡(luò)

通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達基因的篩選和基于各個不同數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，在不同濃度氮處理下的差異表達基因中共篩選出979個差異表達轉(zhuǎn)錄因子(DETF)，在這些DETF中，包括AP2/ERF、Homebox、MYB、NAC以及bHLH等重要的TF家族。結(jié)合PeAQPs啟動子的轉(zhuǎn)錄因子元件分析結(jié)果進行進一步篩選分析，從中篩選出403個可能與PeAQPs有關(guān)的DETFs，它們大致可屬于10個基因家族，其中83個AP2/ERF包含14個AP2、64個ERF和5個RAV亞家族成員。30個C2C2包含20個Dof和10個GATA亞家族成員，在30個B3中還有20個ARF亞家族成員。此外，這403個DETF還包含74個NAC、48個C2H2、42個bZIP、30個HD-ZIP、23個HSF、22個MYB-related、13個SBP、7個MADs-MICK和1個BBR-BPC成員。推測這些DETFs在PeAQPs轉(zhuǎn)錄表達過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，310個DETFs和30個PeAQPs之間形成3 249個共表達基因?qū)ΓY(jié)合PeAQPs的啟動子TF元件結(jié)果，最終篩選出由21個PeAQPs和158個DETF形成的315對共表達關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)。

2.3.1PePIPs共表達網(wǎng)絡(luò)分析

在PePIPs亞家族中，除了PePIP1-2、PePIP2-2和PePIP2-15未鑒定到共表達TF外，其余11個PePIPs與10個TF家族的83個DETF形成153個共表達關(guān)系對，包括91個正向共表達關(guān)系對和62個負向共表達關(guān)系對(圖3)。分析發(fā)現(xiàn)，除了PePIP2-11外，其余10個PePIPs均與14個Dof存在28對正向共表達和21對負向共表達關(guān)系。PePIP1-3和PePIP2-11分別與13個和10個ERF存在共表達關(guān)系，PePIP1-4與3個AP2正向共表達，與2個MYB-related負向共表達。在PePIP1-6、PePIP2-13和PePIP2-14啟動子中均鑒定到bZIP結(jié)合元件，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，也篩選到24個bZIP家族成員與這3個基因分別存在2個、24個和23個共表達關(guān)系。PePIP2-6與11個C2H2共表達，PePIP2-8與5個SBP和6個GATA共表達，這3個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件在PePIPs的其他成員啟動子中均未鑒定到，推測這3個轉(zhuǎn)錄因子可能參與PePIP2-6和PePIP2-8的表達調(diào)控。

2.3.2PeTIPs共表達網(wǎng)絡(luò)分析

在PeTIPs亞家族中，PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP2-1和PeTIP4-1與49個DETF形成53個共表達關(guān)系對，包括34個正向共表達關(guān)系對和15個負向共表達關(guān)系對(圖4)。PeTIP1-1與1個B3和9個NAC正向共表達，與3個NAC負向共表達，而這2類TF與PeTIPs其他成員均無共表達關(guān)系。PeTIP1-2只與3個ERF正向共表達，且PeTIP1-2啟動子中有6個ERF結(jié)合位點，推測這3個ERF可能參與PeAQPs的氮響應(yīng)過程。PeTIP2-1與6個Dof和12個bZIP正向共表達，與3個Dof和10個bZIP負向共表達。PeTIP4-1只與6個Dof存在共表達關(guān)系，且PeTIP4-1的啟動子中鑒定到10個Dof結(jié)合元件，推測Dof與PeTIP4-1的表達存在著密切關(guān)系。

圖3 PePIPs與TFs的共表達分析Fig.3 Co-expression analysis of PePIPs and TFs

圖4 PeTIPs與TFs的共表達分析Fig.4 Co-expression analysis of PeTIPs and TFs

2.3.3PeNIPs和PeSIPs共表達網(wǎng)絡(luò)分析

共表達結(jié)果顯示，5個PeNIPs與6個TF家族的86個成員形成107個共表達關(guān)系對，包括57個正向共表達關(guān)系對和50個負向共表達關(guān)系對(圖5)。PeNIP1-1和PeNIP1-2均只與Dof存在共表達關(guān)系，其中PeNIP1-1和PeNIP1-2均與7個Dof共表達，除此之外，PeNIP1-2還與1個Dof存在共表達關(guān)系。在這2個基因啟動子中，分別鑒定到12個和3個Dof結(jié)合元件。PeNIP1-3與48個TF共表達，包括22個ERF、4個MICK-MADS和22個C2H2，而在其啟動子中，也均存在這3種TF的結(jié)合元件。PeNIP2-2與8個Dof和8個MYB-related共表達，其中包括與3個Dof和2個MYB-related正向共表達。PeNIP2-4與7個Dof和21個HD-ZIP共表達。另外，PeSIP2-1的啟動子中只鑒定到GATA元件，且篩選獲得2個與其具有正向共表達關(guān)系的GATA基因，推測GATA基因?qū)τ赑eSIP2-1的表達發(fā)揮著重要作用。

圖5 PeNIPs和PeSIPs與TFs的共表達分析Fig.5 Co-expression analysis of PeNIPs and PeSIPs with TFs

2.4 關(guān)鍵PeDofs與PeAQPs的相關(guān)性

分析發(fā)現(xiàn)，Dof轉(zhuǎn)錄因子與PeAQPs的3個亞家族成員(8個PePIPs、2個PeTIPs和4個PeNIPs)存在共表達關(guān)系，7個PeDofs與14個PeAQPs存在65對共表達關(guān)系，推測氮處理下PeDofs可能在毛竹根系水分運輸過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用(圖3—圖5)。結(jié)合TF結(jié)合元件的分析結(jié)果，PePIP1-3、PePIP2-13、PePIP2-14、PeTIP4-1、PeNIP1-1和PeNIP2-4等6個基因的啟動子中均具有5個及以上的Dof結(jié)合位點，推測這7個PeDofs通過調(diào)控6個PeAQPs的表達從而影響其水分和氮的吸收與轉(zhuǎn)運。相關(guān)性分析和共表達結(jié)果顯示(圖6)，PeDof_17788、PeDof_21000、PeDof_41006和PeDof_12766與PePIP1-3和PeNIP2-4正向共表達(cor≥0.92)，與PePIP2-13、PePIP2-14、PeTIP4-1和PeNIP1-1等基因負向共表達(cor≤-0.87)；PeDof_38007、PeDof_43753和PeDof_16228則與前4個Dof轉(zhuǎn)錄因子相反。另外，PeDof_21128只與PePIP1-4存在負向共表達關(guān)系。因此，推測這些PeDofs通過不同類型的調(diào)控方式影響PeAQPs的表達，從而影響水分和氮的協(xié)調(diào)運輸。

圖6 關(guān)鍵PeDofs與PeAQPs的相關(guān)性熱圖(A)及共表達網(wǎng)絡(luò)(B)Fig.6 Correlation heat map and co-expression network of key PeDofs and PeAQPs

3 討論

氮是一種重要的大量營養(yǎng)元素，是構(gòu)成植物核酸、蛋白質(zhì)、輔酶因子和植物激素的重要組成部分。氮對植物的生長發(fā)育起著決定性作用，它在植物葉片伸展以及開花過程中的作用已經(jīng)得到了廣泛證實，在植物根系生長和發(fā)育過程中的功能也得到了深入研究。AQP是重要的跨膜通道蛋白，通過細胞和細胞器膜進行水分子的跨細胞運動，同時還參與輸送甘油、尿素、金屬類、二氧化碳、氮氣、過氧化氫和氨等小中性分子。因此，AQP在維持細胞內(nèi)碳氮水平、轉(zhuǎn)運關(guān)鍵調(diào)控分子等方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。不同濃度KNO3處理的毛竹中AQP基因表達差異變化表明，不同的AQP基因可能以不同的方式參與氮的運輸，另外差異表達的TF及其與AQP基因的共表達結(jié)果表明，這些TF在受不同氮處理影響的同時，還參與AQP基因表達的調(diào)控，進而參與毛竹體內(nèi)的水分和氮的運輸，以維持水分平衡和氮分配。

研究表明，AQP基因的表達除受TF調(diào)控外，還受到miRNA的調(diào)節(jié)以及蛋白修飾的影響。如在小麥中tae-miR1131與tae-miR408剪切抑制TaPIP1的表達，熱激蛋白TaHSP90可與TaPIP1相互作用[14]。水稻葉片中水和氮平衡的機制引起參與膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)的廣泛變化，包括水通道蛋白OsPIP2-6的磷酸化[15]。在高濃度氮處理下玉米根系導(dǎo)水率的快速變化與質(zhì)膜中的PIP蛋白豐度相關(guān)，表明PIP翻譯后機制在根系水動力學(xué)參數(shù)的短期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[16]。另外，激素信號也能調(diào)節(jié)AQP基因的表達。在大麥所有HvTIPs基因啟動子區(qū)域中均含有茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)的順式作用基序，MeJA處理導(dǎo)致大麥葉片中氮含量下降[3]。外源脫落酸(ABA)處理，能夠增加大麥莖的導(dǎo)水率和HvPIP2的表達豐度[17]。在大豆GmTIP1;6基因啟動子中含有ABA和MeJA順式作用元件，其表達受ABA和MeJA的強烈誘導(dǎo)[18]。因此，要深入解析竹子快速生長中AQP的作用機制，還需要考慮miRNA的調(diào)節(jié)、AQP翻譯后修飾以及不同激素的影響。