茉莉酸甲酯和水楊酸對西洋參愈傷組織生長和皂苷形成的影響

郝甜甜，陳艷陽，苗佳琪，牛 晨，梁 佳，許永華

吉林農業(yè)大學中藥材學院 人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯合工程研究中心，長春 130118

西洋參(American ginseng，AG)PanaxquinquefoliusL.是五加科人參屬多年生草本植物，其主要活性成分是人參皂苷、皂苷類化合物，它是世界上最常用的中草藥之一[1]。根據現代研究表明，其在降血脂、改善心肌缺血、預防癌癥等方面有顯著功效[2,3]，具有極高的醫(yī)學價值和商業(yè)價值。目前，我國西洋參長期依靠進口且面臨野生資源稀缺，生產成本高、生長周期長，特別是西洋參中稀有皂苷的含量極低，難以滿足臨床應用需求[4,5]。采用藥用植物細胞培養(yǎng)技術，不受時間、地域和材料生長時期的限制，可以在較短時間內獲得大量的西洋參生物量及目標次生代謝產物[6]，值得注意的是，建立起來的西洋參愈傷組織培養(yǎng)系統(tǒng)仍然存在著人參皂苷產量低的問題，影響著西洋參產業(yè)的快速發(fā)展[7]。

隨著誘導子的不斷發(fā)展和廣泛應用，關于誘導子作為一種特定信號，誘導細胞中目的基因表達，從而調節(jié)植物細胞中次生代謝產物合成已成為熱點[8]，而將誘導子用于植物組織培養(yǎng)中促進次生代謝產物的積累研究也變的尤為重要。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和水楊酸(salicylic acid，SA)作為一種常用的誘導子，對多種代謝產物合成具有促進作用，已成功應用于雷公藤、紅花、黃芩、丹參等多種藥用植物次生代謝產物的誘導中[9-12]。目前利用MeJA和SA處理西洋參愈傷組織提高皂苷含量的報道很少。因此，本試驗以西洋參愈傷組織為材料，研究了MeJA和SA處理后對西洋參愈傷組織生長、相關酶活性及主要化學成分人參皂苷含量的影響，為西洋參愈傷組織培養(yǎng)及其次生代謝產物生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料：供試材料培養(yǎng)于吉林農業(yè)大學中藥材學院溫室A04，兩年生西洋參葉片為試驗材料。由吉林農業(yè)大學許永華副教授鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliusL.。以1/4 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 1.0 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH=5.8。培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度60%。

實驗儀器：實驗高壓滅菌器(致微儀器有限公司，GI54DWS型)；雙人單面凈化工作臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司，SW-CJ-2FD型)；智能人工氣候室(南京恒裕儀器設備制造有限公司，FYS-10型)；高效液相色譜儀(美國通微公司，Dionex UltiMate 3000型)；MuItiskan GO酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司-中國)；ST16R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司-中國)。

實驗試劑：MeJA(北京索萊寶科技有限公司，批號：20200118，純度≥95.0%)；SA(北京中科質檢生物技術有限公司，批號為：B20191128，純度≥98.0%)；乙腈和甲醇均為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司-中國)；純凈水(杭州哇哈哈集團有限公司)；SOD試劑盒、CAT試劑盒、POD試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司，貨號分別為SOD-1-Y、CAT-1-Y、POD-1-Y)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

西洋參愈傷組織在培養(yǎng)第 15 d加入誘導子，濃度分別設置為MeJA(50、100、200、300 μmol/L)；SA(50、100、200、300 μmol/L)；以不添加任何誘導子為對照，每個濃度3次重復，10瓶為一重復，25 ℃暗培養(yǎng)，至35 d收獲。

1.2.2 西洋參愈傷組織中生長量的測定

將收獲的人參愈傷組織用濾紙吸干其表面水分，稱其重量記為鮮重(fresh weight，FW)，每6盤一組，重復3次，然后置于50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，稱重記為干重(dry weight，DW)。

1.2.3 抗氧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定采用羥胺法，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定采用可見光法，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4 西洋參愈傷組織中單體皂苷含量的測定

(1)色譜條件：Waters XBridge?C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～35 min，19% A；35～50 min，19% A→22% A；50～108 min，22%A→45% A；蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度：75 ℃，氣體流量：2.5 L/min，增益值：1。

(2)樣品中皂苷的提取方法：稱取愈傷組織100 mg，精密加入1 mL的甲醇，超聲1 h，置于4 ℃ 冰箱過夜，取出，超聲3 h，5 000 r/min 離心5 min，取上清，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜儀檢測，進樣量20 μL。

(3)標準曲線制備：精密稱取標準品人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd適量，加甲醇制成每1 mL分別含上述人參皂苷0.200、0.200、0.194、0.200、0.224、0.210、0.200、0.190、0.204 mg的混合標準品溶液。取上述混合標準品溶液，分別進樣1、2、4、8、16、20 μL，測定各種人參皂苷的峰面積，色譜圖見圖1。

圖1 標準品(A)與西洋參愈傷組織提取物(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard (A) and AG callus extract (B)

1.2.5 西洋參愈傷組織中總皂苷含量的測定

采用香草醛-高氯酸法測定愈傷組織中總皂苷的含量，參考于2020版《中國藥典》[13]，修改處為：取愈傷組織100 mg，精密加入1 mL甲醇，超聲60 min，4 ℃冰箱過夜，超聲3 h。5 000 r/min離心5 min，取上清，待測。其他步驟均同《中國藥典》。以人參皂苷Re為對照品，所得標準曲線為Y=0.002 2X+0.038 7，R2=0.997 5。

1.2.6 數據統(tǒng)計與分析

本試驗數據均使用Microsoft Excel 2019進行統(tǒng)計整理，SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，通過方差分析對比數據差異顯著性；采用OriginPro 2018軟件繪制試驗數據圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織生長的影響

由圖2分析可知，不同濃度誘導子處理對西洋參愈傷組織FW及DW的影響不同。在西洋參愈傷組織中，(1)與對照組相比，各濃度MeJA誘導子處理均顯著降低了愈傷組織的FW，但各濃度處理間的愈傷組織FW并無顯著性差異(P>0.05)，說明MeJA能明顯抑制西洋參愈傷組織的生長；不同濃度的MeJA均會不同程度抑制西洋參愈傷組織干物質的積累，其濃度越高，抑制效果越強。當MeJA濃度為300(μmol/L)時，西洋參愈傷組織DW最低，為0.670 7 g，比對照組降低了27%(P<0.05)。(2)在供試濃度內，SA誘導子對西洋參愈傷組織的生長表現為一定的抑制作用，且誘導濃度不同，對愈傷組織生長的抑制強弱有明顯差異；與對照組相比，各濃度SA均不利于愈傷組織干物質的積累。

圖2 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織FW和DW的影響Fig.2 Effects of different concentrations of inducers on FW and DW in callus of AG注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note:Different lowercase letters in graph indicate significant differences (P<0.05),the same below.

2.2 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織抗氧化酶活性及MDA含量的影響

由圖3分析可知，在西洋參愈傷組織中，(1)同一誘導子處理組下，西洋參愈傷組織中SOD和CAT的活性隨誘導子濃度變化的趨勢并不一致。在供試濃度內，MeJA和SA處理組SOD、CAT活性均顯著高于對照組(P<0.05)。經50 μmol/L濃度MeJA和100 μmol/L濃度SA處理后的西洋參愈傷組織中SOD的活性均達到高峰值，分別為對照組的1.84、2.04、1.94、1.90倍；經100 μmol/L濃度MeJA、50 μmol/L濃度SA處理后的西洋參愈傷組織中CAT活性均達到活性高峰。(2)MeJA和SA的作用濃度對西洋參愈傷組織中POD活性的影響趨勢一致，均隨著誘導子濃度的增加呈現出先上升后下降的趨勢，POD活性誘導峰值分別出現在50 μmol/L濃度MeJA和100 μmol/L濃度SA誘導下。與對照組相比，50 μmol/L至200 μmol/L濃度MeJA能顯著促進MDA含量的增加(P<0.05)；在SA誘導子試驗組內，低濃度SA對MDA含量無顯著影響，高濃度SA能顯著促進MDA含量的積累。

圖3 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織中抗氧化酶活性及MDA含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of inducers on antioxidant enzyme activity and MDA content in callus of AG

2.3 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織皂苷的影響

2.3.1 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織總皂苷的影響

由圖4分析可知，與對照組相比，各濃度誘導子均能顯著促進西洋參愈傷組織中總皂苷含量和產量的增加(P<0.05)。在MeJA誘導作用下，總皂苷的含量和產量隨著其作用濃度的增加呈現先增加后下降的趨勢，但在SA誘導子作用下，總皂苷的含量和產量隨著作用濃度的增加呈現出先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。(1)當MeJA濃度為100 μmol/L時，愈傷組織中總皂苷含量和產量均達到最大值，分別為31.495 8 mg/g和24.465 3 mg，是對照組的4.23和3.86倍。(2)在SA誘導子試驗組中，當SA濃度為300 μmol/L時，西洋參愈傷組織中總皂苷含量和產量均達到最大值，分別為18.537 6 mg/g和14.085 3 mg，是對照組的2.49和2.22倍，但與200 μmol/L濃度SA處理組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織中總皂苷的影響Fig.4 Effects of different concentrations of inducers on total saponins in callus of AG

2.3.2 不同濃度誘導子對西洋參愈傷組織單體皂苷含量的影響

由圖5分析可知，與對照組相比，經適宜濃度MeJA和SA處理的西洋參愈傷組織中單體皂苷的含量均有明顯提高(P<0.05)。(1)當MeJA濃度為100 μmol/L時，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，其含量為2.576 0、2.291 3、7.493 3、0.600 7 mg/g，是對照組的3.78、3.74、3.77、3.11倍。(2)經200 μmol/L濃度SA處理的人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb2的含量最高，其含量為1.874 0、1.712 3、0.517 3、1.517 0 mg/g，是對照組的2.75、2.79、11.50、1.45倍。當SA濃度為300 μmol/L時，人參皂苷Rb1的含量最高，為2.885 3 mg/g，是對照組的5.78倍。

圖5 不同濃度MeJA和SA對西洋參愈傷組織中單體皂苷含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of MeJA and SA on monomoside saponins content in callus of AG

3 討論與結論

雖然誘導子能夠促使植物細胞有目的性的分泌某些次生產物，滿足人類所需求的藥用價值,但所產生的這類次生產物也可能對植物細胞自身的生長發(fā)育造成損傷，降低植物細胞的生物總量。Mao等[14]通過不同濃度的誘導子進行正交實驗研究表明，不同濃度的MeJA和酵母提取物對朱砂愈傷組織的生長具有不同的生理作用；此外，Miao等[15]在試驗中用HPLC測定香豆素含量結果表明，SA和MeJA對北沙參愈傷組織生長及香豆素均有一定的促進作用；Wang等[16]在試驗中指出50～100 μmol/L濃度MeJA會促進銀杏懸浮細胞中黃酮含量的積累，150～200 μmol/L濃度則會抑制其合成。本試驗中選用的MeJA和SA誘導子均對西洋參愈傷組織的生物量產生影響，均阻礙西洋參愈傷組織生長。這可能是因為高濃度的誘導子能激發(fā)植物體內多種脅迫反應，致使細胞內膜系統(tǒng)膨脹、收縮或破損等，破壞了細胞的正常結構，進而抑制了植物組織的生長。

正常條件下生長的植物細胞受到外源誘導子刺激時，細胞內的活性氧水平會表現出不同程度的失調。植物細胞會啟動自身的抗氧化酶系統(tǒng)，利用SOD、CAT、POD等酶的相互協(xié)調配合，以清除體內過剩的自由基，從而保護植株在不良環(huán)境下免遭破壞。MDA作為細胞膜脂發(fā)生過氧化時的產物，能間接反應植物細胞膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[17,18]。Li等[19]研究指出，SA和MeJA對SOD、POD、CAT活性，MDA含量及遠志酮III、3,6′-二芥子?；崽堑姆e累均具有促進作用。Taimoor等[18]發(fā)現蕎麥愈傷組織中POD和SOD活性隨著SA作用時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，在第7周時活性最高。Marziyeh等[20]發(fā)現4%和6%濃度聚乙二醇顯著增加了紅豆杉愈傷組織中MDA含量，但1%、2%、3%和5%濃度聚乙二醇對MDA含量沒有影響。在本研究中發(fā)現2種誘導子在適宜濃度下均可以顯著激活西洋參愈傷組織中抗氧化酶SOD、CAT、POD活性和MDA含量，超出濃度范圍相關酶活性低于對照組，這可能是因為誘導子對抗氧化酶活性影響都有一定限度，如果超過限度，會使酶活性大大降低，致使細胞內活性氧大量積累，從而會危害植物細胞的正常生長。

大量研究表明，不同誘導劑和濃度對同一植物材料的影響有很大差異。例如，通過添加乙酸鈉、SA和Cu2+能不同程度有效的提高北柴胡不定根的產量和柴胡皂苷的含量[21]；低濃度的稀土元素Ce3+能增加銀杏懸浮細胞中黃酮類化合物的產生，但是高劑量的Ce3+會導致細胞死亡[22]。在同一植物中，誘導子誘導次生代謝產物的最佳濃度也不相同。Qi等[23]發(fā)現在絞股藍毛狀根培養(yǎng)中，MeJA、SA和酵母提取物的最佳添加濃度不同，分別不同程度增加毛狀根生長量及總皂苷含量。本試驗中發(fā)現，在西洋參愈傷組織中，2種誘導子均能顯著促進人參皂苷的積累，其中MeJA和SA誘導人參皂苷的最佳濃度分別為100、200 μmol/L，分別是對照組的4.23、2.49倍。另外發(fā)現，不同誘導子及濃度影響西洋參愈傷組織中單體皂苷的合成，其中對單體皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2的影響變化很大。由此得出，在西洋參愈傷組織中，誘導效果為MeJA>SA。在西洋參組織培養(yǎng)中，酵母提取物、SA、硝酸銀、氯化鈣、MeJA、真菌誘導子都能提高人參皂苷的含量，我們的結果與其一致[24-26]。這種結果可能是由多種因素共同作用導致，原因可能與不同誘導子的受體種類、數量有關，雖然低濃度的誘導子對細胞的傷害較小，但可能只會引起植物細胞的部分誘導，使次生代謝產物的含量達不到最高值；也可能與西洋參愈傷中各個內源細胞分裂素水平不同有關，導致次生代謝產物在植物體內涉及多個合成途徑及反應步驟不同，不同誘導子所參與的合成通路不同。因此，選擇合適的誘導子以及最佳的濃度促進西洋參愈傷生長和人參皂苷積累尤為重要。

次生代謝產物是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應的結果,在植物生命活動中有重要意義，還是許多藥物、染料、香料等化合物的重要來源[27]。誘導子是在植物組織培養(yǎng)中誘導新的次生代謝產物或增強生物合成以及積累次生代謝產物最有效和最廣泛使用的生物技術工具之一[14]。本試驗考察了MeJA和SA誘導子對西洋參愈傷組織生長、相關酶活性及人參皂苷含量的影響，結果表明在西洋參愈傷組織中添加適當濃度MeJA和SA均可以顯著激活相關酶活性，提高人參皂苷化合物含量，雖然MeJA抑制生長，但是MeJA濃度為100 μmol/L時，愈傷組織中總皂苷含量和產量均達到最大值，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，所以MeJA誘導人參總皂苷的效果最好。本文為利用誘導子促進西洋參有效成分合成提供了依據，但關于誘導子調控西洋參愈傷中人參皂苷積累的機理，以及如何更有效地協(xié)同利用誘導子促進西洋參愈傷品質的提高，是后續(xù)實驗中需要解決的問題。