劍葉龍血樹內(nèi)生真菌Colletotrichum sp.B-152次生代謝產(chǎn)物研究

張科濤，黃之鐠，趙玉瑛，張 冰，許小蓉，許玉瀟，趙 慶，張曉梅

云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院&中藥學(xué)院，昆明 650500

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指一類生活在健康植物組織體內(nèi)但不引起宿主感染病害的微生物，廣泛存在于健康植物組織中，不僅蘊(yùn)含豐富的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，能產(chǎn)生多種活性成分，還能提高植物的耐鹽、耐旱、耐寒、抗蟲等抗逆性[1,2]。由于內(nèi)生菌具有多種生物活性，因此被認(rèn)為是潛在的藥物候選者[3]，刺盤孢屬(Colletotrichum)含有許多植物內(nèi)生真菌[4,5]，刺盤孢屬因其豐富的生物合成基因簇而成為多種代謝產(chǎn)物的重要來源，如環(huán)磷酸肽、蒽醌、間苯二甲酸內(nèi)酯和吡喃酮等[6,7]，多樣性的刺盤孢屬的提取物和次生代謝產(chǎn)物已被報道具有抑菌活性[8]。

課題組前期發(fā)現(xiàn)從百合科(Liliaceae)龍血樹屬植物(DracaenaVand.ex L.)劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour.) S.C.Chen)葉片組織中分離到的內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.B-152具有廣譜抑菌活性，故對其進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的分離純化，并選取18株病原指示菌為靶標(biāo)，對所獲單體化合物進(jìn)行抑菌活性測試，以期發(fā)現(xiàn)具有潛在抑菌活性的化合物。這不但可以為發(fā)現(xiàn)新型天然活性化合物提供參考，還對豐富刺盤孢屬次生代謝產(chǎn)物及其功能多樣性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株材料

供試菌株：B-152是課題組從前期采自云南省西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn)的劍葉龍血樹葉片組織中分離獲得的一株內(nèi)生真菌。根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)分析鑒定為刺盤孢Colletotrichumsp.。菌種在斜面培養(yǎng)基上活化好后放入4 ℃冰箱，保存于云南中醫(yī)藥大學(xué)天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與研究實(shí)驗(yàn)室。

病原指示菌：大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、肺炎鏈球菌(StreptococcuspneumoniaeBNCC 338425)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis1037)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaPA01)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumaniiATCC 19606)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaeATCC 13883)、流感嗜血菌(HemophilusinfluenzaATCC 10211)；7株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA 1450、2024、1957、28299、I-20、28300、1591)；1株白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)和2株耐氟康唑白色念珠菌臨床分離株(drug-resistantCandidaalbicans63#、1725#)。以上菌株中標(biāo)準(zhǔn)株購于菌種保藏中心，耐藥株由云南省曲靖市第一人民醫(yī)院李宏偉博士提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

抑菌測試培養(yǎng)基：指示細(xì)菌培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.2～7.6；真菌培養(yǎng)基：沙氏培養(yǎng)基50 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

目標(biāo)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L，pH自然；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 30.0 g，NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，水1 L，pH自然。

1.1.3 儀器與試劑

GR-200電子分析天平(廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司)；ES-315 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；LRH-250 生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(Airrtech公司)；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械獨(dú)資工廠)；低溫冷卻水循環(huán)泵(鄭州長盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；AM-400、DRX-500核磁共振波譜儀(Bruker公司)；G6230型高分辨質(zhì)譜儀(Agilent公司)；GF254薄層層析硅膠板、正相柱層析硅膠、反相柱層析ODS(青島海洋化工廠)；TLC Silica gel 60 F254(德國MERCK公司)；培養(yǎng)基所用材料(Thermo Fisher Oxioid 公司)；無機(jī)化學(xué)試劑(天津致遠(yuǎn)化學(xué)儀器有限公司)；有機(jī)化學(xué)試劑(天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 真菌的活化及發(fā)酵

將保藏于4 ℃的菌株B-152接種到PDA上置于28 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7天，再接種到含有40 mL PDB的100 mL三角瓶中培養(yǎng)3天(28 ℃、200 r/min)后得到種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種到擴(kuò)大發(fā)酵的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d(28 ℃，200 r/min)，共發(fā)酵60 L。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

用四層紗布過濾發(fā)酵液，分別得到菌液和菌絲，菌液中加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，菌絲中加入丙酮超聲浸提，直至提取液用TLC檢測無明顯斑點(diǎn)，合并提取液，減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得到粗提物，粗提物經(jīng)95% MeOH-PE分配法脫脂，得到石油醚相(18.9 g)和甲醇相(17.5 g)。

粗提物甲醇相經(jīng)MCI色譜柱，以蒸餾水，30%、50%、70%、100%含水甲醇梯度洗脫，不同餾分經(jīng)TLC檢測，在254、365 nm下觀察，以及碘，硫酸乙醇，碘化鉍鉀顯色，合并得到7個組分(Fr.1～Fr.7)。Fr.1(5.79 g)經(jīng)MCI色譜柱以蒸餾水、30%、50%、70%含水甲醇梯度洗脫得到11個組分(Fr.1.1～Fr.1.11)，F(xiàn)r.1.3(892.3 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到5個組分(Fr.1.3.1～Fr.1.3.5)，F(xiàn)r.1.3.5(392.9 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫得到10個組分(Fr.1.3.5.1～Fr.1.3.5.10)，F(xiàn)r.1.3.5.5(66.2 mg)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=20∶1)洗脫得到化合物3(3.0 mg)；Fr.1.3.5.9(97.9 mg)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=20∶1)洗脫得到化合物4(2.2 mg)。Fr.3(1.01 g)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到8個組分(Fr.3.1～Fr.3.8)，F(xiàn)r.3.2(501.9 mg)經(jīng)正相硅膠柱(石油醚∶丙酮=20∶1)洗脫得到化合物2(10 mg)；Fr.3.3(407.4 mg)經(jīng)正相硅膠柱(石油醚∶丙酮=10∶1)洗脫得到化合物1(4 mg)。Fr.4(4.40 g)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脫得到21個組分(Fr.4.1～Fr.4.21)；Fr.4.11(221.4 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫得到5個組分(Fr.4.11.1～Fr.4.11.5)，F(xiàn)r.4.11.2(111.7 mg)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=100∶1、50∶1、20∶1)梯度洗脫得到5個組分(Fr.4.11.2.1～Fr.4.11.2.5)，F(xiàn)r.4.11.2.2(19 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫得到化合物5(11.6 mg)；Fr.4.14(51.7 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到4個組分(Fr.4.14.1～Fr.4.14.4)，F(xiàn)r.4.14.4(234 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到5個組分(Fr.4.14.4.1～Fr.4.14.4.5)，F(xiàn)r.4.14.4.4(44mg)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=15∶1)洗脫得到化合物6(20.1 mg)；Fr.4.16(94.2 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到6個組分(Fr.4.16.1～Fr.4.16.6)，F(xiàn)r.4.16.5(44 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到4個組分(Fr.4.16.5.1～Fr4.16.5.4)，F(xiàn)r.4.16.5.3(13.2 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱(甲醇)洗脫得到化合物7(6.0 mg)。Fr.5(1.15 g)經(jīng)RP-C-18反相以70%、80%、90%、100%含水甲醇梯度洗脫得到6個組分(Fr.5.1～Fr.5.6)，F(xiàn)r.5.4(386.2 mg)經(jīng)正相硅膠柱(氯仿∶甲醇=100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脫得到15個組分(Fr.5.4.1～Fr.5.4.15)，F(xiàn)r.5.4.5(55.5 mg)經(jīng)正相硅膠柱(石油醚∶丙酮=20∶1、10∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脫得到5個組分(Fr.5.4.5.1～Fr.5.4.5.5)，其中Fr.5.4.5.3為化合物8(10.6 mg)；Fr.5.4.5.2(17.4 mg)經(jīng)正相硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1)洗脫得到化合物9(3.0 mg)。

1.2.3 抑菌活性測試

指示細(xì)菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min黑暗培養(yǎng)12 h，白色念珠菌接種至液體沙氏培養(yǎng)基28 ℃、180 r/min黑暗培養(yǎng)24 h，用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液，備用。

采用濾紙片擴(kuò)散法[9]對單體化合物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。取菌懸液300 μL均勻涂布于固體平板培養(yǎng)基(細(xì)菌涂布于固體LB培養(yǎng)基，真菌涂布于固體沙氏培養(yǎng)基)，用丙酮、甲醇或DMSO溶解化合物至質(zhì)量濃度為5 μg/μL，分別取待測化合物10 μL用微量進(jìn)樣器加到濾紙片(直徑為6 mm)上，待溶劑揮干后貼于已涂供試菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行活性檢測，以等量的抗生素做陽性對照(枯草芽孢桿菌的陽性對照為10 μg)。在實(shí)驗(yàn)中，以卡那霉素(kanamycin sulfate，Kan)作為革蘭氏陰性菌的陽性對照，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)作為革蘭氏陽性菌的陽性對照，以萬古霉素(vancomycin，Van)作為MRSA的陽性對照，以兩性霉素B(amphotericin B，AmB)作為白色念珠菌臨床耐藥株的陽性對照，白色念珠菌28 ℃培養(yǎng)，指示細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色固體，易溶于丙酮等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z215 [M + Na]+；推測分子式為C12H16O2；1H NMR譜中呈現(xiàn)了5個苯環(huán)氫信號(δH7.28～7.17，5 H，m)；2個次甲基信號：δH3.04(1H，m)，4.48(1H，m)；1個亞甲基信號：δH3.10(1H，dd，J= 13.9，6.9 Hz)，2.79(1H，dd，J= 14.0，8.1 Hz)；2個甲基信號：δH1.10(3 H，d，J= 7.0 Hz)，1.0(3 H，d，J= 6.7 Hz)。13C NMR譜中顯示該化合物共有12個碳原子，其中包括6個苯環(huán)碳信號δC127.1(d)，129.0(d)，129.0(d)，130.4(d)，130.4(d)，139.1(s)；2個次甲基碳信號δC77.1(d)，36.7(d)；1個亞甲基碳信號δC40.8(t)；2個甲基碳信號δC18.1(q)，19.1(q)，1個羰基碳信號δC216.1(s)。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，仔細(xì)比對1H和13C NMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)化合物1的結(jié)構(gòu)與已知化合物4-methyl-1-phenyl-2,3-pentanediol(2)的結(jié)構(gòu)最為相似[10]，二者差別在于化合物1中的羰基碳信號(δC216.1，s)對應(yīng)在4-methyl-1-phenyl-2,3-pentanediol(2)中為一個羥基碳信號。結(jié)合HSQC、HMBC和1H-1H COSY譜圖對其碳?xì)鋽?shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步歸屬和驗(yàn)證。HMBC譜中亞甲基質(zhì)子H-1與C-2、C-1′，2′，6′有相關(guān)信號，甲基質(zhì)子H-5、H-6與C-4有相關(guān)信號(見圖1)；綜合上述信息，鑒定化合物1為2-hydroxy-4-methyl-1-phenyl-3-pentanone(結(jié)構(gòu)見圖2)；化合物1的結(jié)構(gòu)已有報道[11]，但完整的核磁數(shù)據(jù)并見報道，本文報道其NMR數(shù)據(jù)如下：1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.28～7.17(5H，m)，4.48(1H，m，H-2)，3.10(1H，dd，J= 13.9，6.9 Hz，H-1)，3.04(1H，m，H-4)，2.79(1H，dd，J= 14.0，8.1 Hz，H-1)，1.10(3H，d，J= 7.0 Hz，H-5)，1.0(3H，d，J= 6.7 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：40.8(t，C-1)，77.1(d，C-2)，216.1(s，C-3)，36.7(d，C-4)，18.1(q，C-5)，19.1(q，C-6)，139.1(s，C-1′)，129.0(d，C-2′，C-6′)，130.4(d，C-3′，C-5′)，127.1(d，C-4′)。

圖1 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY和HMBC信號Fig.1 The key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

圖2 化合物1～9的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of compounds 1-9

化合物2無色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿和丙酮等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z217 [M + Na]+，分子式為C12H18O2；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.26～7.31(5H，m)，3.87(1H，m，H-2)，3.40(1H，m，H-3)，2.93(1H，dd，J= 13.5，5.5 Hz，H-1)，2.73(1H，dd，J= 13.5，8.0 Hz，H-1)，1.87(1H，m，H-4)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-5)，0.96(3H，d，J= 6.8 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(t，C-1)，73.2(d，C-2)，79.1(d，C-3)，29.7(d，C-4)，18.3(q，C-5)，19.0(q，C-6)，138.5(s，C-1′)，128.7(d，C-2′，C-6′)，129.4(d，C-3′，C-5′)，126.6(d，C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]比對，鑒定化合物2為4-methyl-1-phenyl-2,3-pentanediol。

化合物3白色粉末，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z243 [M+H]+，分子式為C10H14N2O5；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.80(1H，s，H-6)，6.27(1H，t，J= 7.0 Hz，H-1′)，4.39(1H，m，H-3′)，3.89(1H，dd，J= 6.5，3.0 Hz，H-4′)，3.78(1H，m，H-5′a)，3.72(1H，m，H-5′b)，2.23(2H，m，H-2′)，1.87(3H，s，CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：152.3(s，C-2)，166.4(s，C-4)，111.5(s，C-5)，138.1(d，C-6)，86.2(d，C-1′)，41.1(t，C-2′)，72.2(d，C-3′)，88.8(d，C-4′)，62.8(t，C-5′)，12.6(q，CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]比對，鑒定化合物3為胸腺嘧啶核苷。

化合物4白色粉末，易溶于水微溶于甲醇；ESI-MS：m/z268 [M+H]+，分子式為C10H13N5O4；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.31(1H，s，H-9)，8.17(1H，s，H-4)，5.95(1H，d，J= 6.5 Hz，H-1′)，4.73(1H，t，J= 6.1 Hz，H-2′)，4.31(1H，dd，J= 12.5，2.5 Hz，H-3′)，4.16(1H，dd，J= 5.1，1.9 Hz，H-4′)，3.87(1H，dd，J= 12.6，2.6 Hz，H-5′a)，3.73(1H，dd，J= 12.5，2.7 Hz，H-5′b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：150.0(s，C-2)，153.4(d，C-4)，157.6(s，C-6)，121.0(s，C-7)，142.0(d，C-9)，91.2(d，C-1′)，75.5(d，C-2′)，72.7(d，C-3′)，88.2(d，C-4′)，63.5(t，C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]比對，鑒定化合物4為腺嘌呤核苷。

化合物5無色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿和甲醇等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z453 [M+Na]+，分子式為C28H46O3；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.27(1H，dd，J= 5.0，2.4 Hz，H-7)，5.24(1H，dd，J= 15.2，7.4 Hz，H-23)，5.22(1H，dd，J= 15.2，8.1 Hz，H-22)，3.98(1H，m，H-3)，3.56(1H，s，H-6)，1.07(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.94(3H，d，J= 3.9 Hz，H-28)，0.88(3H，d，J= 4.5 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 4.5 Hz，H-27)，0.66(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：31.8(t，C-1)，34.0(t，C-2)，68.4(d，C-3)，40.7(t，C-4)，77.0(s，C-5)，74.2(d，C-6)，119.1(d，C-7)，143.8(d，C-8)，44.4(d，C-9)，38.2(s，C-10)，23.0(t，C-11)，40.5(t，C-12)，44.7(s，C-13)，55.9(d，C-14)，24.0(t，C-15)，29.2(t，C-16)，57.4(d，C-17)，12.8(q，C-18)，18.9(q，C-19)，41.8(d，C-20)，21.7(q，C-21)，137.0(d，C-22)，133.2(d，C-23)，44.4(d，C-24)，34.4(d，C-25)，20.1(q，C-26)，20.4(q，C-27)，18.2(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13,14]比對，鑒定化合物5為(22E,24R)-ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol。

化合物6白色固體，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z727 [M]+，分子式為C41H77NO9；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.74(1H，dt，J= 15.4，5.4 Hz，H-5)，5.51(1H，dd，J= 15.4，6.8 Hz，H-4)，5.16(1H，bt，J= 7.0 Hz，H-8)，4.28(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′′)，4.15(1H，t，J= 6.8 Hz，H-3)，4.11(1H，dd，J= 10.2，5.6 Hz，H-1a)，4.00(1H，m，H-2′)，3.74(1H，dd，J= 10.2，3.6 Hz，H-1b)，3.66(1H，m，H-6′′a)，3.21(1H，dd，J= 9.0，7.8 Hz，H-6′′b)，3.33～3.29(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)，2.09(4H，m，H-10，H-7)，1.99(2H，m，H-6)，1.61(3H，s，H-19)，1.41(2H，m，H-3′)，1.35～1.25(38H，s，CH2×19，H11～17，H4′～15′)，0.93(6H，t，J= 6.4 Hz，CH3×2，H-18，H-16′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：69.7(t，C-1)，54.6(d，C-2)，72.9(d，C-3)，134.6(d，C-4)，131.1(d，C-5)，33.0(t，C-6)，33.7(t，C-7)，124.8(d，C-8)，136.7(s，C-9)，40.7(t，C-10)，14.4(q，C-18)，16.1(q，C-19)，177.1(s，C-1′)，73.1(d，C-2′)，35.8(t，C-3′)，14.4(q，C-16′)，104.7(d，C-1")，74.9(d，C-2")，77.9(d，C-3")，71.5(d，C-4")，77.9(d，C-5")，62.6(t，C-6")，30.8～23.7(t，C-11～17，C-4′～15′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]比對，鑒定化合物6為(4E,8E)-N-D-2′-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine。

化合物7白色粉末，易溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z591 [M-H]-，分子式為C34H56O8；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.31(1H，t，J= 2.7 Hz，H-7)，5.25(2H，m，H-22，23)，4.59(1H，br s，H-6′a),4.44(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6′b)，4.16(2H，m，H-4′)，3.88(2H，br d，J= 8.0 Hz，H-2′)，3.69(2H，dd，J= 9.4，4.5 Hz，H-5′)，1.10(3H，s，H-19)，1.07(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.86(3H，d，J= 6.8 Hz，H-26)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：34.0(t，C-1)，30.0(t，C-2)，76.3(d，C-3)，38.3(t，C-4)，76.9(s，C-5)，74.4(d，C-6)，119.0(d，C-7)，143.8(s，C-8)，44.4(d，C-9)，37.3(s，C-10)，23.0(t，C-11)，40.7(t，C-12)，44.7(s，C-13)，55.9(d，C-14)，24.0(t，C-15)，29.1(t，C-16)，57.4(d，C-17)，12.8(q，C-18)，20.1(q，C-19)，41.8(d，C-20)，21.7(q，C-21)，137.0(d，C-22)，133.3(d，C-23)，44.4(d，C-24)，34.4(d，C-25)，20.5(q，C-26)，18.8(q，C-27)，18.2(q，C-28)，102.4(d，C-1′)，75.1(d，C-2′)，78.2(d，C-3′)，71.7(d，C-4′)，78.0(d，C-5′)，62.9(t，C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]比對，鑒定化合物7為tuberosider。

化合物8白色固體，易溶于丙酮等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z429 [M + H]+，分子式為C28H44O3；1H NMR(400 MHz，CDC13)δ：6.51(1H，d，J= 8.5 Hz，H-7)，6.25(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J= 15.2，7.4 Hz，H-23)，5.14(1H，dd，J= 15.3，7.8 Hz，H-22)，3.97(1H，m，H-3)，0.99(3H，d，J= 6.4 HZ，H-21)，0.90(3H，d，J= 6.4 Hz，H-28)，0.88(3H，s，H-19)，0.83～0.80(9H，m，CH3×3，H-18，26，27)；13C NMR(100 MHz，CDC13)δ：34.8(t，C-l)，30.2(t，C-2)，66.5(d，C-3)，37.1(t，C-4)，82.3(s，C-5)，135.5(d，C-6)，135.3(d，C-7)，79.5(s，C-8)，51.2(d，C-9)，37.1(t，C-10)，23.5(t，C-11)，39.5(t，C-12)，44.7(d，C-13)，51.8(d，C-14)，20.7(t，C-15)，28.7(t，C-16)，56.3(d，C-17)，13.0(q，C-18)，18.3(q，C-19)，39.8(d，C-20)，21.0(q，C-21)，130.8(d，C-22)，132.4(d，C-23)，42.9(d，C-24)，33.2(d，C-25)，19.7(q，C-26)，19.6(q，C-27)，17.7(q，C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,17]比對，鑒定化合物8為(22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol。

化合物9白色固體，易溶于丙酮等有機(jī)溶劑；ESI-MS：m/z270 [M]+，分子式為C17H34O2；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.27(2H，m，H-16)，1.56(2H，m，H-15)，1.19(26H，s，CH2×13，H2～14)，0.81(3H，m，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：14.1(q，C-1)，22.7(t，C-2)，31.9(t，C-3)，24.7(t，C-15)，29.1、29.2、29.3、29.4、29.6、29.6、29.6、29.7、29.7、30.9、30.9(t，C4～14)，33.7(t，C-16)，177.3(s，C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]比對，鑒定化合物9為十七烷酸。

2.2 抑菌活性檢測

在選取的18種指示菌進(jìn)行的抑菌活性實(shí)驗(yàn)中，化合物1～9以及對照品的抑菌圈大小見表1?；衔?、3、4、5僅對其中一種指示菌顯示出有抑菌活性；化合物1對枯草芽孢桿菌ATCC 6633和鮑曼不動桿菌ATCC 19606有微弱的抑制作用，化合物6對白色念珠菌ATCC 10231和耐氟康唑白色念珠菌臨床分離株1725#具有抑制作用，化合物9對大腸桿菌ATCC 25922和耐氟康唑白色念珠菌臨床分離株63#有抑制作用；化合物7對5株指示菌(大腸桿菌ATCC 25922、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、流感嗜血菌ATCC 10211、MRSA 28299和白色念珠菌ATCC 10231)有抑制作用；化合物8的抑菌比較廣譜，對11株指示菌都顯示出抑菌活性，包括3株革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌ATCC 6633、肺炎鏈球菌BNCC 338425和恥垢分枝桿菌1037)、3株革蘭氏陰性菌(大腸桿菌ATCC 25922、鮑曼不動桿菌ATCC 19606和肺炎克雷伯菌BNCC 338425)、4株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA 2024、1957、28299、28300)和1株指示真菌(白色念珠菌 ATCC 10231)均有不同程度的抑制作用，其中對鮑曼不動桿菌ATCC 19606的抑菌活性最好，抑菌圈達(dá)到12.00 mm。

表1 Colletotrichum sp.B-152代謝產(chǎn)物的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of secondary metabolites isolated from Colletotrichum sp. B-152

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 討論與結(jié)論

我們從劍葉龍血樹分離保存的內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.B-152的次生代謝產(chǎn)物中共分離出9個化合物，化合物2～4、6、7、9為首次從刺盤孢屬真菌中分離得到。其中2-hydroxy-4-methyl-1-phenyl-3-pentanone(1)作為天然產(chǎn)物首次報道。從抑菌活性結(jié)果來看，化合物5、7和8的結(jié)構(gòu)為同系列化合物，但表現(xiàn)出的活性不一樣，其構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證；化合物2對鮑曼不動桿菌ATCC 19606抑菌活性強(qiáng)于化合物1，這可能與兩個化合物結(jié)構(gòu)在3號位的取代基不同有關(guān)。此外，已有研究表明腺嘌呤核苷(4)具有體外抗流感病毒(H1N1)的活性[19]；(22E,24R)-ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol(5)對胃癌SGC-7901細(xì)胞有較強(qiáng)抑制活性[20]；(4E,8E)-N-D-2′-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine(6)對單純皰疹病毒(HSV-1)的抑制活性是陽性藥利巴韋林的20倍，對腸道病毒71(EV71)的抑制活性是陽性藥利巴韋林活性的5倍[21]；tuberosider(7)有較強(qiáng)的抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和狗腎細(xì)胞MDCK增殖的活性[22]；(22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(8)對小鼠肺腺癌細(xì)胞A-549有一定的抑制作用[23]。這些研究表明從刺盤孢Colletotrichum真菌分離的化合物在抑菌、抗病毒和抗腫瘤方面具有良好的活性，也為發(fā)掘新型抗菌藥物及活性天然產(chǎn)物提供了新的依據(jù)。