樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別和HPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識別分析 Δ

段雨晴 ，朱田密 ，陳樹和 ，段雪云 ，王思萌 （1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；.湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院藥事部，武漢 430061）

樺褐孔菌為銹革孔菌科真菌樺褐孔菌Inonotus obliquus（ Fr.） Pilat的干燥菌核，菌核全年均可采收，為硬木質(zhì)，不易腐爛[1—3]。樺褐孔菌主要分布于北半球北緯40°～50°地區(qū)，如俄羅斯的西伯利亞和遠(yuǎn)東地區(qū)，日本的北海道及芬蘭、波蘭等地；在我國，主要分布于黑龍江省小興安嶺和吉林省長白山等地[4]?，F(xiàn)代研究表明，樺褐孔菌化學(xué)成分主要包含多糖類、多酚類、三萜類、甾醇類和葉酸衍生物類等，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[5—6]。

樺褐孔菌是一種新來源的真菌類藥材，在歷代醫(yī)藥典籍中均無記載，但在地方標(biāo)準(zhǔn)《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2012版）和《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2018版）中收載[1—2]。目前，國內(nèi)外對樺褐孔菌的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面，缺乏對樺褐孔菌藥材質(zhì)量控制的全面研究?！渡綎|省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2012版）僅從性狀、顯微鑒別、浸出物等方面對樺褐孔菌藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，未規(guī)定指標(biāo)性成分；《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2018版）含量測定項下僅以栓菌酸為質(zhì)量控制的指標(biāo)，較為單一，難以全面有效地反映樺褐孔菌藥材的質(zhì)量。故本研究建立樺褐孔菌藥材中三萜類成分栓菌酸、樺褐孔菌醇的薄層色譜鑒別方法和樺褐孔菌藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并應(yīng)用化學(xué)模式識別分析（聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析）評價該藥材的質(zhì)量，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Alliance e2695型高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器（美國 Waters公司），ES225SM-DR型電子天平（瑞士Precisa公司），UPT-11-10T型超純水機(jī)（深圳優(yōu)普特技術(shù)有限公司），KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

栓菌酸對照品由本實驗室自制，純度為93.9%；樺褐孔菌醇、羊毛甾醇對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（批號分別為B50360、B27054，純度均不低于95%）；麥角甾醇對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號111845-202105，純度≥96.6%）。本研究所用樺褐孔菌藥材（S1～S18為商品藥材，購自湖北辰美中藥有限公司、保和堂制藥有限公司、廣州康和藥業(yè)有限公司；S19～S22為筆者親自采摘后晾干得到）經(jīng)湖北省中醫(yī)院藥事部陳樹和主任藥師鑒定為銹革孔菌科真菌樺褐孔菌I.obliquus（Fr.） Pilat的干燥菌核，樣品信息見表1。

表1 22批樺褐孔菌藥材的樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別

2.1.1 栓菌酸的薄層色譜鑒別 取樺褐孔菌藥材粉末（過四號篩）1 g，加異丙醇20mL，超聲（頻率45 kHz，功率400 W）處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為供試品溶液。取栓菌酸對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502薄層色譜法，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃條件下加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1。

圖1 樺褐孔菌藥材中栓菌酸的薄層色譜圖

2.1.2 樺褐孔菌醇的薄層色譜鑒別 按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液。取樺褐孔菌醇對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液，作為對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502薄層色譜法，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶0.3∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃條件下加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖2。

圖2 樺褐孔菌藥材中樺褐孔菌醇的薄層色譜圖

2.2 樺褐孔菌藥材的HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～12 min，90%A→95%A；12～15 min，95%A；15～16 min，95%A→100%A；16～39 min，100%A；39～40 min，100%A→90%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備。取樺褐孔菌藥材粉末（過四號篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，超聲處理30 min；放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。（2）對照品溶液的制備。取栓菌酸、樺褐孔菌醇、麥角甾醇、羊毛甾醇對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為368.84、201.02、390.37、285.76 μg/mL的單一對照品溶液。精密吸取各單一對照品溶液2、5.5、0.5、2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得栓菌酸、樺褐孔菌醇、麥角甾醇、羊毛甾醇質(zhì)量濃度分別為73.77、110.56、19.52、57.15 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 精密度考察 取供試品溶液（S3號樣品），按照“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.49%，相對峰面積RSD均小于3.99%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（S3號樣品）于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.88%，相對峰面積RSD均小于2.89%（n＝6），表明樣品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性考察 精密稱取S3號樺褐孔菌藥材粉末2 g，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.75%，相對峰面積RSD均小于4.06%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 HPLC指紋圖譜的建立 取22批樺褐孔菌藥材粉末2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將22批樺褐孔菌藥材的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行分析。選取S17號樣品作為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，經(jīng)多點矯正，生成樺褐孔菌藥材的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜。另外，取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，22批樺褐孔菌藥材共有10個共有峰；與混合對照品色譜圖對比后，指認(rèn)出3號峰為栓菌酸，4號峰為樺褐孔菌醇，9號峰為麥角甾醇，10號峰為羊毛甾醇。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 混合對照品溶液HPLC色譜圖

圖4 樺褐孔菌藥材HPLC疊加指紋圖譜

2.2.7 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》計算22批樺褐孔菌藥材HPLC圖譜的相似度。結(jié)果顯示，與對照指紋圖譜相比，各批樺褐孔菌藥材樣品圖譜的相似度在0.942～0.995之間，表明各批樣品間相似度良好。

2.3 樺褐孔菌藥材的化學(xué)模式識別分析

2.3.1 聚類分析 以22批樺褐孔菌藥材指紋圖譜中10個共有峰峰面積為參量，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類，并繪制樹狀圖（圖5）。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離＞10時，22批樺褐孔菌樣品可以分為兩類，其中S1～S15、S19、S21、S22聚為第1類，S16～S18、S20聚為第2類。該聚類分析結(jié)果提示，樺褐孔菌藥材間存在一定差異。

圖5 22批樺褐孔菌藥材的聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析 為綜合評價不同批次間樺褐孔菌藥材質(zhì)量的差異，將22批樣品10個共有峰的峰面積作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行主成分分析。以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，共得到3個主成分，其特征值分別為5.927、1.711、1.318，對總方差的累積貢獻(xiàn)率為89.522%，說明這3個主成分可以反映22批樺褐孔菌藥材大部分的信息，提示樺褐孔菌藥材的質(zhì)量差異是由多種化學(xué)成分共同引起的。由表2可知，主成分1可以反映共有峰2、3（栓菌酸）、4（樺褐孔菌醇）、6、7、10（羊毛甾醇）的信息，主成分2可以反映共有峰1、9（麥角甾醇）的信息，主成分3可以反映共有峰5、8的信息。

表2 主要因子載荷矩陣

以上述3個主成分對22批樺褐孔菌藥材進(jìn)行綜合評價，參考文獻(xiàn)[7]方法，計算主成分得分：Z1＝-0.185x1+0.212x2+0.060x3+0.212x4+0.114x5+0.196x6+0.091x7-0.088x8-0.065x9+0.316x10；Z2＝0.508x1-0.057x2+0.188x3-0.054x4-0.087x5-0.025x6+0.154x7+0.006x8+0.384x9-0.253x10；Z3＝0.058x1+0.019x2+0.142x3-0.008x4+0.351x5-0.052x6+0.089x7+0.629x8-0.184x9-0.288x10。其 中，Z1、Z2、Z3代表主成分1、2、3的得分值；x1～x10代表主成分因子的10個共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值。根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率與3個主成分總貢獻(xiàn)率之比計算權(quán)重系數(shù)[8]，再計算主成分綜合得分（Z綜）：Z綜＝59.267/89.522×Z1+17.108/89.522×Z2+13.178/89.522×Z3，主成分綜合得分越高說明質(zhì)量越好[9]，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，主成分綜合得分排名前4位的樣品分別為S17、S18、S16、S20。

表3 22批樺褐孔菌藥材主成分得分和綜合得分

將22批樺褐孔菌藥材10個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1軟件繪制主成分得分圖（圖6）。結(jié)果顯示，S16～S18、S20樣品可與其他樣品區(qū)分開，說明這4批樣品與其他樣品存在差異，且與聚類分析結(jié)果相印證。

圖6 22批樺褐孔菌藥材主成分得分圖

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別分析 為更好地考察引起不同批次樺褐孔菌藥材質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分，筆者以22批樺褐孔菌藥材指紋圖譜共有峰峰面積為變量，進(jìn)一步采用正交偏最小二乘法-判別分析對樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型中，累計解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.953和0.918，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.869，均大于0.5，提示本研究所建模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力較好。設(shè)置分類矩陣變量隨機(jī)排列200次做置換檢驗，所得R2和Q2截距值分別為0.167、-0.751（均小于置換檢驗?zāi)Ｐ陀疑戏降恼鎸峈2和Q2值），說明建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型不存在過度擬合現(xiàn)象，可用于判別分析[10]。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，值越大，表明該色譜峰的貢獻(xiàn)越大[11]。以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出4號峰（樺褐孔菌醇，VIP值＝1.86）、3號峰（栓菌酸，VIP值＝1.62），7號峰（VIP值＝1.27）可能是影響不同批次間樺褐孔菌質(zhì)量的標(biāo)志性成分。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別時提取溶劑和展開劑的選擇

樺褐孔菌藥材薄層色譜鑒別時，分別考察了不同提取溶劑（甲醇、異丙醇、三氯甲烷）對藥材提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以三氯甲烷為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的薄層色譜斑點有干擾；以甲醇為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的提取效果較差，薄層色譜斑點不清晰；以異丙醇為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的提取效果較好，薄層色譜斑點清晰無干擾，故本實驗采用異丙醇為提取溶劑。另外，本實驗還考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯、三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醚、二氯甲烷-甲苯-甲酸-甲醇、三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇等不同展開劑對栓菌酸、樺褐孔菌醇分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶1∶1）為展開劑時，栓菌酸的分離效果較好，比移值適中，斑點清晰；以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶0.3∶0.3）為展開劑時，樺褐孔菌醇的分離效果較好。

3.2 HPLC指紋圖譜研究時提取溶劑及色譜條件的選擇

在制備供試品溶液時，筆者考察了異丙醇、甲醇、三氯甲烷等提取溶劑對樺褐孔菌藥材HPLC圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用極性較大的甲醇、異丙醇為提取溶劑時，雜質(zhì)峰較大，且栓菌酸等成分色譜峰的響應(yīng)較差；以三氯甲烷為提取溶劑時，雜質(zhì)峰較小，特征色譜峰數(shù)量增多，響應(yīng)更強(qiáng)，且更易于識別，故本實驗采用三氯甲烷為提取溶劑。

本實驗比較了不同流動相（甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水）對各色譜峰分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動相時，各色譜峰峰形尖銳，分離效果較好。另外，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測波長為203 nm時，HPLC圖可最大程度化地反映各色譜峰的信息，故本研究選擇203 nm作為檢測波長。

3.3 化學(xué)模式識別分析

本研究將22批樺褐孔菌藥材的HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式識別分析相結(jié)合，以評價其質(zhì)量。結(jié)果顯示，聚類分析可將22批樺褐孔菌藥材聚為兩類，即S16～S18、S20為一類，其余樣品為另一類；進(jìn)一步由主成分綜合得分可知，S16～S18、S20這4批樣品的綜合得分排名靠前，表明這4批樣品質(zhì)量較好。經(jīng)筆者前期觀察也發(fā)現(xiàn)，這4批樣品質(zhì)地堅硬沉重，菌肉顏色較深，而綜合得分較低的藥材質(zhì)地輕泡松軟，顏色較淺，這提示樺褐孔菌藥材質(zhì)量可能與質(zhì)地色澤存在一定相關(guān)性。研究表明，在樺褐孔菌的生長過程中，其色澤由淡黃逐漸變成深褐色[12]。但由于樺褐孔菌均為野生，無法實現(xiàn)規(guī)?；娜斯ぴ耘郲3]，故無法推知其具體生長年限。因此，后續(xù)可將樺褐孔菌藥材菌肉顏色和質(zhì)地作為其質(zhì)量評價依據(jù)。本研究采用正交偏最小二乘法-判別分析篩選出3個影響樺褐孔菌藥材質(zhì)量的標(biāo)志性成分，分別為樺褐孔菌醇、栓菌酸及色譜峰7所代表的化學(xué)成分。研究表明，樺褐孔菌醇具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用[13—14]，栓菌酸具有抗炎、抗腫瘤、抗胃潰瘍、降糖、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[15—16]。因此，后續(xù)研究可將上述3種成分作為樺褐孔菌藥材質(zhì)量控制的評價指標(biāo)。

綜上所述，本研究成功建立了樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別方法及HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可為樺褐孔菌藥材的質(zhì)量控制提供參考。