miR-18b-5p調(diào)控WWOX對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響

蘇保壽，薛治乾，余鵬飛，吳益敏，喻聞慶

膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其基因多態(tài)性與病人預(yù)后及生存時(shí)間有關(guān)，雖然手術(shù)、放療和烷基化劑化療是治療的主要手段，但個(gè)體化治療策略可改善預(yù)后和延長(zhǎng)生存時(shí)間[1-2]。研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，可為膠質(zhì)瘤病人提供個(gè)體化策略并改善預(yù)后。

有研究[3]用芯片篩選膠質(zhì)瘤組織中差異表達(dá)的miRNA，并將膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤腦組織進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)miR-18b在膠質(zhì)瘤中上調(diào)表達(dá)；另一研究[4]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-18b在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)；但miR-18b-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響目前還不清楚。包含WW域的氧化還原酶基因(WWOX)在膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，WWOX基因缺失或低表達(dá)在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中起重要作用[5]，且上調(diào)WWOX的表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的免疫反應(yīng)[6]。WWOX和miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用，而兩者是否存在某種調(diào)控關(guān)系尚不明確。本研究探討了miR-18b-5p對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討WWOX在此機(jī)制中的作用。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年6月至2017年6月于本院病理檢查確診為膠質(zhì)瘤的病人手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織(距離膠質(zhì)瘤組織邊緣>2 cm)各56例，男30例，女26例，年齡18～66(41.02±14.6)歲，膠質(zhì)瘤分級(jí)：Ⅰ級(jí)5例、Ⅱ級(jí)12例、Ⅲ級(jí)19例、Ⅳ級(jí)20例。所有病人術(shù)前未接受放療和化療。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與所有病人簽訂知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自美國ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；引物、WWOX干擾物(si-WWOX)、miR-18b-5p mimics(miR-18b-5p)、miR-18b-5p抑制劑(anti-miR-18b-5p)、陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)WWOX突變型和野生型載體購自上海吉瑪制藥有限公司；WWOX抗體、Cyclin D1抗體、p21抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；流式細(xì)胞儀和流式試劑盒(購自美國BD公司)；顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%青-鏈霉素、谷氨酰胺和丙酮酸鈉的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于濕度95%、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和各載體或片段，包括anti-miR-NC、anti-miR-18b-5p、miR-NC、miR-18b-5p、si-NC、si-WWOX、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX、anti-miR-18b-5p+si-NC、anti-miR-18b-5p+si-WWOX、WT-WWOX+miR-NC、WT-WWOX+miR-18b-5p、MUT-WWOX+miR-NC和MUT-WWOX+miR-18b-5p的載體，將等體積脂質(zhì)體與各組載體輕柔混勻，室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，混勻后常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，換成DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，通過Real-timePCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 Real-timePCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U251細(xì)胞、膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，保存于-80 ℃。然后取總RNA按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，同樣-80 ℃保存。按照 real-timePCR的說明書取cDNA進(jìn)行反應(yīng)合成miR-18b-5p，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后48 h的U251細(xì)胞，消化細(xì)胞并用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，以2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96微孔板中，分別在培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光度值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組U251細(xì)胞，接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，洗滌2次，根據(jù)流式試劑盒說明書操作，加入100 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和 10 μL碘化丙啶，室溫避光15 min，再加入400 μL Binding buffer，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，室溫裂解細(xì)胞20 min，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉1 h，然后將膜加入稀釋的一抗中(WWOX抗體1∶2 000、Cyclin D1抗體1∶5 000、p21抗體1∶4 000、Bax抗體1∶3 000、Bcl-2抗體1∶1 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4 ℃過夜，用緩沖液洗膜2次，加入稀釋后的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，洗膜，顯影。分析蛋白表達(dá)量。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) U251細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的WWOX的野生型(WT-WWOX)和突變型(MUT-WWOX)雙熒光素酶報(bào)告載體分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-18b-5p，培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，離心收集裂解后的上清液，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算WT-WWOX和MUT-WWOX的相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用兩獨(dú)立樣本t(或t′)檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤瘤旁組織中的表達(dá) 與瘤旁組織(0.52±0.05)相比，在膠質(zhì)瘤組織中miR-18b-5p的表達(dá)量(1.31±0.13)升高(t=42.44，P<0.01)(見圖1)。

2.2 抑制miR-18b-5p表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的miR-18b-5p表達(dá)量下降，細(xì)胞活性在24、48和72 h均下降，增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)量下降，p21表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率上升，凋亡蛋白Bax表達(dá)上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)(見圖2和表1～2)。

表1 抑制miR-18b-5p表達(dá)對(duì)細(xì)胞U251凋亡率及細(xì)胞活性的影響

表2 抑制miR-18b-5p表達(dá)對(duì)細(xì)胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-18b-5p靶向調(diào)控WWOX miR-18b-5p的序列中含有與WWOX3′UTR互補(bǔ)的核苷酸序列(見圖3)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與對(duì)照miR-NC組相比，miR-18b-5p組野生型WT-WWOX的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性下降(P<0.01)，而突變型MUT-WWOX的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性無明顯變化(P>0.05)(見表3)。與miR-NC組相比，miR-18b-5p組的WWOX蛋白表達(dá)量降低；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的WWOX表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表4)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 WWOX蛋白蛋白的表達(dá)

2.4 過表達(dá)WWOX可抑制U251細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與pCDNA3.1組相比，pCDNA3.1- WWOX組的WWOX蛋白表達(dá)量升高，增殖蛋白Cyclin D1表達(dá)降低，p21表達(dá)上升，細(xì)胞活性在24、48和72 h均下降，凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖4和表5～6)。

表5 過表達(dá)WWOX對(duì)細(xì)胞U251的細(xì)胞活性及凋亡率的影響

表6 過表達(dá)WWOX對(duì)細(xì)胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制WWOX表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的WWOX蛋白表達(dá)量升高，miR-18b-5p表達(dá)量下降，細(xì)胞活性在24、48和72 h均下降，Cyclin D1表達(dá)量下降，p21表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率上升，Bax表達(dá)上升，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)，anti-miR-18b-5p+si-NC組與anti-miR-18b-5p組結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p+si-WWOX組與anti-miR-18b-5p組結(jié)果相反(P<0.05～P<0.01)(見圖5和表7～8)。

表7 抑制WWOX表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對(duì)細(xì)胞U251的細(xì)胞活性就凋亡率的影響(x±s)

表8 抑制WWOX表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對(duì)細(xì)胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(x±s)

3 討論

miRNA在膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)，可能是膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。miRNA富含于大腦，其差異表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生起重要作用，其參與受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成、侵襲、分化抑制、細(xì)胞周期增強(qiáng)和凋亡抑制[8]。識(shí)別關(guān)鍵的miRNA也可為開發(fā)膠質(zhì)瘤有效的生物標(biāo)志物和抑制性RNA策略提供依據(jù)。

miR-18b-5p在多種腫瘤組織中表達(dá)異常。WANG等[9]最新研究發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇抵抗的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/PR中，miR-18b-5p是lncRNA AC073284.4的直接靶點(diǎn)，AC073284.4可通過上調(diào)DOCK4靶向結(jié)合miR-18b-5p，從而減輕乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-18b-5p在結(jié)直腸癌病人血漿[10]和大腸癌組織[11]中表達(dá)上調(diào)，通過下調(diào)PTEN表達(dá)誘導(dǎo)PI3K/Akt2信號(hào)通路持續(xù)活化，促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展。miR-18b-5p在前列腺癌中表達(dá)降低，與腫瘤惡性程度有關(guān)，對(duì)預(yù)測(cè)前列腺癌具有較高的敏感性和特異性[12]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，miR-18b在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，在膠質(zhì)瘤癌組織中miR-18b-5p的表達(dá)量顯著升高，抑制miR-18b-5p表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤中具有重要作用。

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，WWOX的3′UTR中含有與miR-18b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示兩者可能存在結(jié)合位點(diǎn)或調(diào)控關(guān)系，WWOX可能參與miR-18b-5p對(duì)膠質(zhì)瘤的調(diào)控過程。WWOX包含兩個(gè)WW域和一個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶域的相對(duì)分子質(zhì)量為46 000的蛋白質(zhì)，是一種腫瘤抑制因子，在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、肺癌、胃癌和胰腺癌中表達(dá)缺失或減少，位于染色體16q23，跨越人類基因組第二常見的脆弱位點(diǎn)FRA16D[13]。WWOX在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中表達(dá)下調(diào)，其可誘導(dǎo)p53突變的GBM細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制GBM[14]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G中高表達(dá)WWOX可抑制細(xì)胞增殖和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。對(duì)3 622名中國成年人的研究發(fā)現(xiàn)，WWOX基因缺失可能易患膠質(zhì)瘤[16]。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)WWOX可抑制U251細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與這些研究結(jié)果一致，說明WWOX可抑制膠質(zhì)瘤。

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明，miR-18b-5p靶向負(fù)調(diào)控WWOX的表達(dá)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制WWOX表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-18b-5p表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，說明兩者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中具有調(diào)控關(guān)系。miRNA的主要功能是在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，每個(gè)miRNA調(diào)節(jié)多個(gè)靶標(biāo)基因的表達(dá)[17]。因此，miR-18b-5p/WWOX的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本研究證實(shí)miR-18b-5p和WWOX在膠質(zhì)瘤中具有重要的作用，miR-18b-5p和WWOX有望做為膠質(zhì)瘤分子診治靶點(diǎn)。