銀杏葉提取物對地卓西平致精神分裂癥模型大鼠的改善作用及其機(jī)制研究

朱莉文，孫彩敬

精神分裂癥屬于重性精神疾病，病人主要特征為認(rèn)識(思維與感知)、行為活動異常。在人們生產(chǎn)生活方式不斷改變的今天，精神分裂癥臨床發(fā)病率表現(xiàn)出逐年升高趨勢。地卓西平(MK-801)可以通過拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體方式模擬精神分裂癥病人陽性(快速移動)與陰性(包括刻板行為和焦慮情緒)癥狀[1-2]。臨床常對精神分裂癥采取利培酮進(jìn)行治療，尤其對于合并情感障礙病人，可產(chǎn)生良好的療效[3]。當(dāng)前，銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)治療精神分裂癥相關(guān)研究很多，但涉及MK-801致精神分裂癥模型大鼠實驗的相關(guān)作用機(jī)制研究較少。鑒于此，本研究以上述模型大鼠為對象，研究給予EGB對該模型大鼠的改善作用及其機(jī)制，以期為EGB的進(jìn)一步研發(fā)及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只Sprague-Dawley(SD)大鼠，且均為成年雄性，體質(zhì)量為250～300 g，來自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK(黑)2013-004。置于20～26 ℃環(huán)境飼養(yǎng)，濕度控制為50%～60%，對其定期清洗消毒，飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 儀器 LC-6A型高效液相色譜儀，購自日本島津公司；AG125型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；離心機(jī)(型號為TGL-16)，購自上海醫(yī)療器械廠)；WHI型漩渦震蕩器，購自浙江樂成電器廠；TU-1900型雙光束紫外線可見光光度計，購自北京普析通用儀器公司；Morris水迷宮與曠場實驗相關(guān)測試系統(tǒng)，由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1.3 主要藥品及試劑 自行配置的0.9%氯化鈉溶液；MK-801(美國SIGMA公司，臨用時將其配制為0.01 mg/mL的注射液)；EGB761(Beaufour Ipsen Industrie，臨用時將其配制為100 mg/L的溶液)；利培酮(齊魯制藥，國藥準(zhǔn)字：H20041807，臨用時將其配制為0.036 mg/mL的混懸液)；丙二醛(MDA)試劑盒(批號：A003)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：A001-3)，均購自南京建成生物工程研究所；自行配置的95%乙醇；谷氨酸(Glu)標(biāo)準(zhǔn)品，購自sigma公司；蒸餾水等。

1.4 方法

1.4.1 分組、建模及給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、對照組與實驗組，各10只。模型組、對照組與實驗組大鼠采取腹腔注射方式注入0.01 mg/mL MK-801，取下側(cè)腹腔較為靠近外側(cè)1/3部位，連續(xù)注射2周；空白組大鼠連續(xù)注射2周0.9%氯化鈉溶液，注射體積同其他3組。建模后，對照組大鼠每天使用0.05 mL/kg利培酮懸浮液進(jìn)行灌胃治療；實驗組每天使用200 mg/kg EGB761進(jìn)行灌胃治療；另外2組使用等體積蒸餾水，連續(xù)2周。

1.4.2 大鼠血清及組織中相關(guān)指標(biāo)檢測 Glu表達(dá)測定：采取HPLC-ECD法，在1 mL預(yù)冷95%乙醇之中加入大鼠額前腦組織，進(jìn)行離心處理，取5 mg樣品放入離心管，再添加衍生工作液50 μL，進(jìn)行渦旋震蕩處理1 min之后，取20 μL放進(jìn)色譜儀，詳細(xì)記錄色譜圖，最后計算峰面積，獲取Glu表達(dá)情況。以黃嘌呤氧化酶法(WST-1)進(jìn)行血清SOD水平的測定；以硫代巴比妥酸法(TBA)進(jìn)行血清MDA水平的測定；均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 鼠Morris水迷宮實驗觀察 逃避潛伏期：灌胃治療結(jié)束前5 d，把4組大鼠置于Morris水迷宮之中自由游泳1 min，讓其熟悉環(huán)境，確保大鼠泳姿以及速度正常，在治療結(jié)束前4、3、2、1、0 d(評估第1、第2、第3、第4、第5天)把4組大鼠置于Morris水迷宮之中訓(xùn)練，每只訓(xùn)練2組/天，1 min內(nèi)沒有找到平臺表明逃逸潛伏期60 s，把各大鼠置于不同象限，注意放入時保證其面向水池壁，詳細(xì)記錄具體逃逸潛伏期。

1.4.4 大鼠曠場實驗行為觀察 曠場實驗：完成逃避潛伏期檢測后，采用曠場實驗測試系統(tǒng)(組成包括分析軟件、測驗箱、視頻圖樣采樣卡以及視頻合成器等)跟蹤大鼠活動，記錄其具體活動軌跡，并且算出活動路程；其中測驗箱選擇排凈水Morris水迷宮，控制環(huán)境之內(nèi)均照明200 lx，并且伴50 dB白噪音，把大鼠置于無安全平臺相應(yīng)無水水池之中，大鼠依然尋找安全平臺，使其自由活動10 min，詳細(xì)記錄大鼠穿越次數(shù)、中央活動路程比(中心區(qū)活動路程/總路程)、中央活動時間比(中心區(qū)活動時間/總時間)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清MDA、SOD水平及腦組織Glu表達(dá)比較 與空白組相比，模型組大鼠MDA水平明顯升高，SOD、Glu表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，對照組與實驗組MDA水平明顯降低，SOD、Glu表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比，實驗組Glu表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。各組大鼠腦組織Glu HPLC色譜圖見圖1。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD水平及腦組織Glu表達(dá)比較

2.2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 評估第1天、第2天，與空白組相比，模型組、對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而模型組、對照組與實驗組3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。評估第3天、第4天、第5天，與模型組相比，對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而對照組與實驗組2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較

2.3 各組大鼠曠場實驗行為比較 與空白組相比，模型組大鼠穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，對照組與實驗組穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，對照組與實驗組2間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較

3 討論

MK-801能夠通過抑制神經(jīng)沖動與人腦中興奮傳導(dǎo)通路，阻礙神經(jīng)興奮傳導(dǎo)，最終引起神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙。同時，MK-801也能有效阻斷顳葉-海馬系統(tǒng)與額葉-海馬系統(tǒng)NMDA受體，導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞功能出現(xiàn)缺陷。因而，實驗常采用MK-801建立精神分裂癥動物模型。有研究[4]表明，隨EGB761劑量增加，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，高劑量癥狀改善效果更好。故本研究直接選擇200 mg·kg-1·d-1EGB761，未根據(jù)劑量分組進(jìn)行研究。

SOD清除氧自由基主要通過催化超氧陰離子O2-生成過氧化氫H2O2方式，再由過氧化氫酶(CAT)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)催化H2O2形成具有安全無害性產(chǎn)物[水(H2O)與氧(O2)]，同時SOD亦能保護(hù)CAT以及GSH-Px不被O2-滅活，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞。相關(guān)研究[5]表明，精神分裂癥病人會產(chǎn)生血清抗氧化物質(zhì)水平異常現(xiàn)象，推測腦內(nèi)存在大量氧自由基，同時生理性清除功能減弱，使得脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷加重，對病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮毒性作用，可能促進(jìn)精神分裂癥發(fā)生及發(fā)展。MDA屬于機(jī)體內(nèi)氧自由基在抗氧化物質(zhì)參與鏈?zhǔn)椒磻?yīng)下形成的降解產(chǎn)物，可一定程度反映精神分裂癥病人體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，如果氧自由基堆積量增多，則會加劇脂質(zhì)過氧化，由此會生成大量MDA。氧化-抗氧化系統(tǒng)動態(tài)平衡被破壞，將出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腦組織之中神經(jīng)細(xì)胞，引起精神分裂癥等各種精神障礙疾病，而SOD和MDA表達(dá)與氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷具有相關(guān)性。有研究指出，Glu系統(tǒng)活動異常，可對神經(jīng)元可塑性產(chǎn)生影響，引起神經(jīng)毒性，同時啟動神經(jīng)元分泌Glu等遞質(zhì)，對γ-氨基丁酸能神經(jīng)元上相應(yīng)NMDA 受體產(chǎn)生作用，從而形成負(fù)反饋作用來調(diào)節(jié)Glu釋放水平；MK-801可以破壞該循環(huán)回路里面的NMDA 受體，引起興奮性傳導(dǎo)處于脫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致腦內(nèi)遞質(zhì)失衡，最終引發(fā)精神癥狀[6-7]。相關(guān)研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，EGB能夠起到保護(hù)Glu導(dǎo)致的興奮性毒性損害的功效。EGB治療精神分裂癥主要倫理依據(jù)為：發(fā)揮抗氧化以及質(zhì)膜穩(wěn)定功能，EGB可優(yōu)化中樞神經(jīng)能力代謝狀態(tài)，減少自由基，有效降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，達(dá)到改善腦血液流變性目的[10-11]。本實驗中，與空白組相比，模型組大鼠MDA水平明顯升高，SOD、Glu表達(dá)水平明顯降低；與模型組相比，對照組與實驗組MDA水平明顯降低，SOD、Glu表達(dá)水平明顯升高；與對照組相比，實驗組Glu表達(dá)水平明顯升高。提示大鼠模型存在血清MDA水平顯著升高、血清SOD水平與腦組織Glu表達(dá)顯著降低的現(xiàn)象，而EGB能夠促進(jìn)血清MDA、SOD水平和腦組織Glu表達(dá)恢復(fù)，產(chǎn)生良好的抗氧化與抑制脂質(zhì)過氧化的功效。

Morris水迷宮可用于評估大鼠空間認(rèn)知功能與記憶學(xué)習(xí)能力[12]。曠場實驗?zāi)軌蛟u估情緒反應(yīng)情況、中樞興奮狀態(tài)、自主探索活動能力以及運動功能等，通常中央?yún)^(qū)域探索活動量降低，說明中樞興奮性減弱，出現(xiàn)情緒障礙(如抑郁)行為；如果周邊區(qū)域自主活動逐漸增多，則表示興奮性升高且出現(xiàn)焦慮恐懼情緒[13-14]。同時，曠場實驗也能在一定程度上將模型大鼠記憶能力有效反映出來。本實驗結(jié)果顯示，評估第1天、第2天，與空白組相比，其余3組逃避潛伏期具有明顯延長表現(xiàn)，且3組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義；評估第3天、第4天、第5天，與模型組相比，對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯縮短；與空白組相比，模型組大鼠平均穿越次數(shù)、中央活動時間比以及中央活動路程比明顯更大；與模型組相比，對照組與實驗組平均穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比明顯增加，與蔡菡等[15]研究結(jié)論一致。說明EGB能夠提高精神分裂癥大鼠認(rèn)知與學(xué)習(xí)記憶能力，改善不良情緒。

綜上所述，EGB對MK-801致精神分裂癥模型大鼠的改善作用機(jī)制可能為通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善Glu功能障礙引起的精神分裂癥狀，從而提高記憶、認(rèn)知能力，緩解不良情緒狀態(tài)。但本次實驗樣本較少，且未比較不同劑量與不同時間處理結(jié)果，具有一定局限性，更詳細(xì)、確切的作用機(jī)制仍待后續(xù)更全面、更大樣本的研究進(jìn)一步證實。