多孔化對鈦合金羥基磷灰石涂層及生物活性的影響

張?jiān)讫?李若琳

（江蘇理工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇常州 213001）

鈦及鈦合金具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，因此成為骨科和牙科修復(fù)用代表性植入物材料。但在臨床中發(fā)現(xiàn)，鈦的彈性模量遠(yuǎn)高于宿主骨，可能引起受載下的應(yīng)力屏蔽效應(yīng)，導(dǎo)致種植體失效［1］。此外，鈦是生物惰性材料，而作為植入體需要具備一定的生物活性。因此，提高生物活性和降低彈性模量是生物鈦合金的研究重點(diǎn)。

研究人員通過等離子噴涂、化學(xué)沉積和物理沉積等表面改性技術(shù)提高鈦植入體表面的生物活性，促進(jìn)骨融合［2］。羥基磷灰石（簡稱HA）是一種生物陶瓷，具有良好的生物相容性和生物活性，是目前常用的硬組織修復(fù)和替代材料之一。HA可通過體內(nèi)的生化反應(yīng)誘導(dǎo)新骨在種植體和原骨的交界處生長，從而與骨組織形成牢固的結(jié)合。通過在鈦合金表面形成HA涂層，可增強(qiáng)種植體的生物相容性，還可減緩對人體有害的鋁和釩離子的釋放［3］。對于HA涂層材料的研究，主要集中在表面涂層與金屬基體之間的界面結(jié)合強(qiáng)度，以及涂層對植入體生物活性和生物相容性的影響。

多孔化是降低彈性模量的有效方法，通過調(diào)節(jié)多孔鈦的孔隙率，可使其彈性模量與宿主骨相匹配［4］。相較于密實(shí)種植體，多孔支架還具備更好的滲透性及涂層的結(jié)合強(qiáng)度，孔壁可增強(qiáng)種植體與周圍骨組織之間的機(jī)械互鎖，有效地避免剪切力的破壞，使其在體內(nèi)獲得充分的骨長入［5］。多孔種植體的孔隙率、孔徑和孔隙形態(tài)對骨的生長有很大的影響，較高的孔隙率有望促進(jìn)骨生長，但對鈦種植體的力學(xué)性能不利。為了平衡骨傳導(dǎo)性和強(qiáng)度，多孔鈦的孔隙率應(yīng)在30%—80%之間［6］。大多數(shù)研究者認(rèn)為［7-9］，骨長入的最佳孔徑為150—600 μm，孔隙的相互連通性是骨長入的關(guān)鍵因素，適當(dāng)?shù)目讖接欣诠情L入和分化［9］。鈦網(wǎng)真空擴(kuò)散連接是一種較為簡便且可設(shè)計(jì)性高的多孔鈦制備方法，通過控制鈦網(wǎng)孔徑、層疊方式、擴(kuò)散連接工藝參數(shù)等，可以調(diào)整種植體的孔隙率和結(jié)合強(qiáng)度，從而調(diào)控其力學(xué)相容性和生物相容性［10］。本文采用該方法制備醫(yī)用多孔鈦TA2，并在其表面沉積HA涂層，研究了密實(shí)鈦和多孔鈦表面涂層的形貌和成分，以及多孔化對生物活性的影響，探討了HA涂層的形成機(jī)理，表征了成骨細(xì)胞的粘附及鋪展形貌，通過MTT法測試了細(xì)胞的相對增值率。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 多孔鈦及其表面HA涂層的制備

采用鈦網(wǎng)真空擴(kuò)散連接法制備塊體多孔鈦。以孔徑400 μm、絲徑150 μm的方孔醫(yī)用TA2網(wǎng)為原料，根據(jù)設(shè)計(jì)孔隙率和樣品高度計(jì)算出所需鈦網(wǎng)的層數(shù)。在制備前先將鈦網(wǎng)的表面進(jìn)行清洗、干燥，再將經(jīng)表面處理過的鈦網(wǎng)逐層堆疊，然后放入真空擴(kuò)散連接爐內(nèi)，擴(kuò)散連接溫度為750℃、保持時間為1.5 h、真空度維持在6×10-3Pa左右，制備出設(shè)計(jì)孔隙率為50%的多孔TA2樣品。根據(jù)質(zhì)量-體積法計(jì)算實(shí)際樣品的孔隙率P=（1-m/V·ρ）×100%，其中m、V和ρ分別是多孔鈦的質(zhì)量、體積和TA2的密度。從TA2板材中切取等尺寸的密實(shí)塊體作為對比試樣。TA2的成分列于表1。

表1 TA2鈦網(wǎng)和板材的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of TA2 titanium mesh and sheet

對樣品進(jìn)行超聲波酸洗處理，以去除表面臟污，所用酸洗液配比為1：3：6的氫氟酸、硝酸和蒸餾水，隨后在丙酮、酒精、去離子水中依次用超聲波清洗20 min，然后放入裝有NaOH水溶液（5.0 mol·L-1）的密封塑料試管中，在60℃下恒溫水浴保溫24 h后取出，再用去離子水清洗，于空氣中干燥。以3oC·min-1的升溫速率加熱至630oC，保溫1 h后隨爐冷卻至室溫。

預(yù)鈣化處理：將兩種樣品放入裝有Na2HPO4（濃度0.5 mol·L-1）溶液的塑料密封試管中浸泡24 h，取出后放入裝有飽和Ca（OH）2溶液的塑料密封試管中浸泡5 h，隨后用去離子水清洗，然后將兩組樣品置于36.5oC模擬體液（SBF，化學(xué)試劑用量見表2）中浸泡14 d，浸泡過程中每48 h更換一次SBF，以（CH2OH）3CNH2溶液作為緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至7.25，最終得以在兩組試樣表面制備鈣磷涂層（HA涂層）。

表2 配制1000 mL模擬體液所用的化學(xué)試劑及用量Table 2 The chemical regents and dosage used to prepare of 1000ml of simulated body fluid（SBF）

1.2 體外細(xì)胞毒性測試

在毒性測試前需對試樣進(jìn)行高溫滅菌，本實(shí)驗(yàn)采用直接接觸和浸提液2種方式對試樣進(jìn)行120℃下20 min的高溫滅菌。浸提液法，所需的介質(zhì)為含血清培養(yǎng)基，浸提溫度、時間分別為（37±1）℃和（72±2）h，要求試樣的厚度小于5 mm，根據(jù)6 cm2·mL-1的比例浸提液體積為0.66 mL。

采用基于觀測細(xì)胞代謝活性的MTT法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性的定量測試。MTT為黃色溶于水的試劑，其會被活細(xì)胞代謝還原成藍(lán)紫色的甲贊，用異丙醇溶解甲贊，用分光光度計(jì)測量光密度，活細(xì)胞的數(shù)目同光密度成正比。

將小鼠前成骨體外細(xì)胞以2×104的細(xì)胞密度種植于24孔板，連續(xù)培養(yǎng)5 d，采用MTT法檢測小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖情況。首先將所培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來后，取100 mL的細(xì)胞液加入96孔板中，再加入100 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后每孔加 入20 μL的MTT（5 g·L-1），靜 置4 h后再加入150 μL的DMSO（二甲基亞砜），最后利用酶標(biāo)儀于波長490 nm下檢測各孔的吸光度（OD），從而計(jì)算出細(xì)胞的相對增殖率。將未經(jīng)消化的孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出倒掉，加入95%的乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定10 min，用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗兩次后進(jìn)行干燥處理，通過SEM觀察試樣表面的細(xì)胞形貌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 涂層表面形貌及成分分析

圖1為浸泡模擬體液14 d后的密實(shí)鈦表面涂層形貌及組成成分。從圖1（a—b）可見密實(shí)鈦試樣表面被具有三維孔隙結(jié)構(gòu)的鈣磷涂層（HA涂層）均勻覆蓋，涂層的厚度為2—4 μm。對涂層（圖1（b）方框中的區(qū)域）進(jìn)行EDS分析，得到密實(shí)鈦表面涂層元素含量（見圖1（c）），其中Ca的原子分?jǐn)?shù)為5.69%、P為3.31%，鈣磷原子比為1.72，與標(biāo)準(zhǔn)HA的鈣磷比1.67相近，表明密實(shí)鈦表面形成了HA涂層。

圖1 浸泡模擬體液14 d后密實(shí)鈦表面涂層形貌及成分分析Figure 1 Surface coating morphology and composition analysis of dense titanium after 14 days of immersion in SBF

制備的多孔鈦的孔隙率為53%，與設(shè)計(jì)值較為接近。圖2為浸泡模擬體液14 d后多孔TA2表面的涂層形貌及組成成分，從圖2（a—b）可見，多孔鈦表面的鈣磷涂層附著均勻，由于其為多孔結(jié)構(gòu)，纖維連接處的涂層較厚，涂層的厚度分布在3—5 μm之間，沒有觀察到鹽類析出物。對涂層（圖2（b）方框中的區(qū)域）進(jìn)行EDS分析，得到多孔鈦表面涂層元素含量（見圖2（c）），其中Ca、P的原子分?jǐn)?shù)分別為3.40%和1.89%，鈣磷比為1.80，與標(biāo)準(zhǔn)HA接近，證明多孔鈦表面形成了HA涂層。

圖2 浸泡模擬體液14 d后多孔鈦表面涂層形貌及成分分析Figure 2 Surface coating morphology and composition analysis of porous titanium after 14 days of immersion in SBF

試樣表面HA涂層的形成機(jī)理。在堿處理過程中，Ti與OH-群之間發(fā)生反應(yīng)后釋放氣體，反應(yīng)生成的鈦酸鈉和二氧化鈦的結(jié)構(gòu)為三維孔隙結(jié)構(gòu)，從而使多孔鈦表面具備了生物活性，便于HA的形核。預(yù)鈣化過程中，樣品表面的鈦酸鈉水解形成帶負(fù)電的活性Ti-OH，Ca2+被靜電引力均勻吸附到表面的活性羥基位上。在浸泡SBF過程中，PO43-與Ca2+發(fā)生反應(yīng)而均勻附著在Ca2+表面，同時又有Ca2+均勻吸附到PO43-表面，層層疊加吸附后形成了均勻分布的HA［11］。

2.2 HA涂層對成骨細(xì)胞粘附行為的影響

圖3為MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)5 d后的細(xì)胞形態(tài)圖。從圖3可見，HA涂層鈦表面黏附的黑色陰影與顯微鏡中觀察到的培養(yǎng)瓶底部黏附的小鼠前成骨細(xì)胞形態(tài)一致，可推斷此陰影為HA涂層密實(shí)鈦表面黏附的小鼠前成骨細(xì)胞。表明，細(xì)胞在HA改性的密實(shí)鈦表面可以黏附，呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞鋪展和生長的現(xiàn)象。

圖3細(xì)胞培養(yǎng)5 d后的形貌圖Figure 3 Morphology of the cells after 5 days of culture

圖4為多孔鈦表面細(xì)胞培養(yǎng)5 d后的HA改性多孔鈦表面細(xì)胞粘附及鋪展微觀形貌。從圖4可以看出：細(xì)胞在HA改性的多孔鈦表面粘附量較未改性表面大大增加，由于細(xì)胞有聚集生長的特點(diǎn)，因此會出現(xiàn)單根鈦纖維表面細(xì)胞密集粘附及鋪展；成骨細(xì)胞有向孔內(nèi)生長的趨勢，這說明經(jīng)過羥基磷灰石改性的多孔鈦更有利于成骨細(xì)胞的鋪展和生長，提高生物的相容性。

圖4 成骨細(xì)胞在HA改性多孔鈦表面的粘附及鋪展微觀形貌Figure 4 Adhesion and spreading morphology of osteoblasts on HAmodified porous titanium surface

2.3 體外細(xì)胞毒性測試分析

由于吸光度OD值對應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，OD值越高表明細(xì)胞數(shù)越多。對密實(shí)鈦和多孔鈦進(jìn)行MTT測試，結(jié)果如圖5所示。從圖5可見：對照組為未放置試樣的細(xì)胞培養(yǎng)組，細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，對照組細(xì)胞全部貼壁；以對照組為100%，多孔浸提液、密實(shí)浸提液、多孔鈦及密實(shí)鈦的細(xì)胞存活率分別為56.4%、33.3%、47.6%和21.1%，說明多孔HA改性鈦支架比密實(shí)鈦支架更有利于細(xì)胞生長，可促進(jìn)多孔鈦表面細(xì)胞的早期黏附、增殖和分化。

圖5 各樣品中OD值Figure 5 The OD value of each sample

所得MTT檢測結(jié)果與SEM觀察到的現(xiàn)象互相印證。經(jīng)過多孔化處理后，同體積試樣的表面積顯著增大，為細(xì)胞早期的黏附和增殖提供了更多的形核位置。涂層特有的開放多孔結(jié)構(gòu)，使培養(yǎng)液可以更好的流動，不會造成局部培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗過大，使他在孔內(nèi)維持住平均水平。纖維之間的搭接，為細(xì)胞提供了多向生長的機(jī)會，使細(xì)胞從一個二維平面鋪展升級到三維空間內(nèi)生長。

3 結(jié)論

采用鈦網(wǎng)真空擴(kuò)散連接法成功制備了設(shè)計(jì)孔隙率的多孔鈦TA2。在模擬體液中浸泡14 d后，鈦表面形成了厚度為3—5 μm的HA涂層。多孔鈦表面的細(xì)胞存活率高于密實(shí)鈦，HA改性多孔鈦支架比密實(shí)鈦支架更有利于細(xì)胞生長，通過跨纖維孔內(nèi)填充生長實(shí)現(xiàn)多孔鈦表面生物相容性的提高。