滴定法測(cè)定羧甲基殼聚糖取代度的方法改進(jìn)

肖莉，李輝，張堃

（愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司，北京 101204）

羧甲基殼聚糖為殼聚糖氨基糖單元的6-OH上的H被羧甲基取代后的產(chǎn)物，通過取代度，即樣品中羧甲基的總摩爾數(shù)占試樣中總的氨基糖單元摩爾數(shù)的百分?jǐn)?shù)，來衡量羧甲基殼聚糖羧甲基化的程度。

《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》（YY/T 0953—2020）中附錄B提供了取代度的測(cè)定方法[1]，實(shí)際操作時(shí)，因第一拐點(diǎn)突躍較小且不明顯，往往不能在滴定曲線上直接讀取，甚至在原始數(shù)據(jù)中也不能確定第一拐點(diǎn)值。因此，業(yè)內(nèi)對(duì)羧甲基殼聚糖產(chǎn)品取代度測(cè)定的難點(diǎn)多集中在第一突躍點(diǎn)的尋找上。

因羧化程度、羧化位置以及羧甲基存在形式的不同，羧化后得到羧甲基殼聚糖其實(shí)是各種羧甲基殼聚糖的混合物[2-3]，根據(jù)殼聚糖上各基團(tuán)的反應(yīng)性分析，羧甲基取代的難易程度順序?yàn)镹位＞O位（由難到易）[4]。另據(jù)文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，當(dāng)用過量鹽酸溶解羧甲基殼聚糖，采用電位滴定法用氫氧化鈉滴定時(shí)，不同取代形成的第一突躍點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH不同，故文獻(xiàn)資料中選擇pH 2.2下對(duì)應(yīng)的體積作為V1的簡(jiǎn)化處理方式，在理論上是可行的。但是，這種處理方式是在假定羧甲基只以酸型或鹽型中某一種型體存在，因此計(jì)算過程會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，不能真實(shí)反映過剩鹽酸的含量，導(dǎo)致最終的取代度結(jié)果不準(zhǔn)確，并帶來了因取樣量的差別而使結(jié)果無法重復(fù)的問題。

本文在《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》（YY/T 0953—2020）中附錄B取代度測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了定量等體積的酸空白，扣除樣品游離氨基和解離羧基凈結(jié)合H+能力，消除樣品固有游離結(jié)構(gòu)帶來的影響，可準(zhǔn)確、重復(fù)的得到樣品實(shí)際結(jié)合鹽酸后過剩的體積。希望能夠解決行業(yè)上采用滴定法測(cè)定羧甲基殼聚糖取代度時(shí)第一拐點(diǎn)無法準(zhǔn)確、重復(fù)判斷的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羧甲基殼聚糖，批號(hào)：20200113，愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司；鹽酸，藥用輔料，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，藥用輔料，分析純，天津海光藥業(yè)有限公司；醋酸銨，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醋酸鈉，三水合物，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉滴定液，0.1 mol/L，國(guó)家化學(xué)試劑質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；916 Ti-Touch型電位滴定儀，瑞士萬通公司；RCT basic safety control型磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液制備

1.3.1.1 溶劑

取鹽酸、氯化鈉，用水分別稀釋后混合成0.1 mol/L鹽酸溶液（含0.1 mol/L氯化鈉）。

1.3.1.2 供試液

取樣品約300 mg，精密稱定，加溶劑30.0 mL使溶解，制成10 mg/mL溶液。

1.3.1.3 陽性對(duì)照液

取醋酸銨或醋酸鈉約100 mg，精密稱定，加溶劑30.0 mL使溶解，制成3.3 mg/mL溶液。

1.3.2 試驗(yàn)方法

取供試液，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，用電位滴定儀記錄滴定液消耗的體積與pH值。另精密量取溶劑30.0 mL作為空白，按供試液滴定方法同法操作。按下述方法分別找出3個(gè)突躍點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的滴定液消耗體積（mL）。

計(jì)算供試液的一階微商（?pH/?V），以滴定溶液的消耗體積為橫坐標(biāo)，?pH/?V為縱坐標(biāo)做圖，得到一階微商曲線；在pH值為3.5～10.0時(shí)，曲線的兩個(gè)峰值即為第二、三突躍點(diǎn)，分別記錄其對(duì)應(yīng)的體積V2（mL）、V3（mL）。

按式（1）計(jì)算第一突躍點(diǎn)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V1（mL）。

式中：VB0、VB2.2和VB2分別為空白在滴定終點(diǎn)時(shí)、pH=2.2時(shí)和V2對(duì)應(yīng)pH點(diǎn)時(shí)所對(duì)應(yīng)的滴定液消耗體積，mL；VY2.2和V2分別為供試液在pH=2.2和第二突躍點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的滴定液消耗體積，mL。

將上述確定的V1、V2、V3代入YY/T 0953—2020附錄B中公式，計(jì)算樣品的取代度[1]。

1.3.3 方法準(zhǔn)確性

取陽性對(duì)照液進(jìn)行滴定。一階微商曲線制作方法同1.3.2，記錄各陽性對(duì)照曲線的各個(gè)峰對(duì)應(yīng)的pH及其消耗氫氧化鈉的體積（VY1、V2），并在空白對(duì)照溶液中尋找這些pH點(diǎn)對(duì)應(yīng)的空白消耗氫氧化鈉體積（VB1、VB2）；另記錄空白的等當(dāng)點(diǎn)消耗氫氧化鈉的體積（VB0）。

陽性樣品中羧甲基含量和羧甲基的理論含量按式（2）和式（3）計(jì)算。

式中：59為羧甲基（CH3COO-）分子量；V1為過剩鹽酸消耗的氫氧化鈉體積[V1=VB0-（VB1-VY1）-（VB2-V2）]，mL；V2為第二突躍點(diǎn)消耗的氫氧化鈉體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定濃度，mol/L；m為樣品稱樣量，mg；M為各陽性對(duì)照樣品的分子量，醋酸銨為77，醋酸鈉（三水合物）為136。

1.3.4 線性與范圍

精密稱定樣品240～360 mg，共5份，按照1.3.2方法檢測(cè)，計(jì)算樣品的?V1和?V2；分別以?V1、?V2為縱坐標(biāo)，樣品的質(zhì)量（W）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.3.5 重復(fù)性

取樣品約300 mg，共6份，按照1.3.2方法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確性

如表1所示，醋酸銨和醋酸鈉中檢測(cè)的羧甲基含量與理論值偏差不超過5%，表明使用本方法測(cè)定羧甲基的原理基礎(chǔ)具有一定的準(zhǔn)確性。

表1 醋酸銨和醋酸鈉中羧甲基含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

2.2 線性與范圍

?V1、?V2與稱樣量的回歸方程分別為y=0.038 8x+0.784 1，R=0.990 7；y=0.032 5x-0.016，R=0.994 4；在240.4～360.0 mg取樣范圍內(nèi)，?V1、?V2與取樣量的線性關(guān)系均良好（R＞0.99）。

2.3 重復(fù)性

由表2可知，6份羧甲基殼聚糖取代度的平均值為101.5%，RSD為4.3%，顯示方法的重復(fù)性良好。

表2 羧甲基殼聚糖取代度檢測(cè)重復(fù)性考察結(jié)果（n=6）

如圖1和圖2所示，典型的羧甲基殼聚糖取代度滴定曲線上可見第二和第三突躍點(diǎn)，但第一突躍點(diǎn)不明顯，無法直接讀取第一拐點(diǎn)值，若選擇某一pH（如pH2.2）下對(duì)應(yīng)的體積作為V1，計(jì)算過程會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，不能真實(shí)反映過剩鹽酸的含量，因此采用

圖1 典型取代度滴定過程圖

圖2 典型取代度一階微商圖

1.3.2 中式（1）計(jì)算第一突躍點(diǎn)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。

3 討論

本文深入分析了鹽酸溶解樣品和氫氧化鈉滴定的離子化學(xué)過程。向樣品中緩慢加入鹽酸過程：當(dāng)加鹽酸至第二突躍點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH（一般為3.6～5.3）時(shí)，樣品中的所有解離羧基結(jié)合H+而成化合態(tài)，此時(shí)鹽酸的加入量（V′），用消耗氫氧化鈉滴定液的量表示，應(yīng)為樣品所有解離羧基結(jié)合鹽酸的量；繼續(xù)加鹽酸至pH值為2.0～2.2時(shí)，樣品的氨基和固有游離羧酸被轉(zhuǎn)化成季銨鹽的形式，此時(shí)鹽酸的加入量（V′′），用消耗氫氧化鈉滴定液的量表示，應(yīng)為樣品所有氨基的結(jié)合鹽酸的量；繼續(xù)加鹽酸至過量，鹽酸的加入量為V1；整個(gè)過程加入的鹽酸總量（VB0），用消耗氫氧化鈉滴定液的量表示，應(yīng)為空白等當(dāng)點(diǎn)的消耗。此處應(yīng)有：VB0=V′+V′′+V1。

相反的，用氫氧化鈉滴定鹽酸溶鹽的過程：在滴定到pH為2.0～2.2時(shí)，消耗的氫氧化鈉為過剩鹽酸和樣品中固有游離羧酸貢獻(xiàn)之和；繼續(xù)滴定至第2突躍點(diǎn)（V2）時(shí)，消耗的氫氧化鈉為結(jié)合鹽酸的羧基貢獻(xiàn)；繼續(xù)滴定至第3突躍點(diǎn)（V3）時(shí)，消耗的氫氧化鈉為結(jié)合鹽酸的氨基貢獻(xiàn)。此過程中，理論第一突躍點(diǎn)應(yīng)在pH 2.2之前，消耗的氫氧化鈉才恰為過剩鹽酸貢獻(xiàn)（即 V1）[7]。

因此可通過改進(jìn)措施，采用加入定量過量的H+，分別滴定空白和樣品，再在滴定曲線上找出VB0、VB2.2、VY2.2、VB2、V2；通過公式 VB0=V′+V′′+V1計(jì)算樣品中凈過剩鹽酸的量V1[即V1=VB0-（VB2.2-VY2.2）-（VB2-V2）]，再按照《醫(yī)用羧甲基殼聚糖》（YY/T 0953—2020）中附錄B中的公式可計(jì)算出準(zhǔn)確的取代度。

4 結(jié)論

文章建立了羧甲基殼聚糖取代度的檢測(cè)方法，通過加入定量過量的鹽酸，并引入空白對(duì)照，兼顧了樣品的實(shí)際分子狀態(tài)，提高了羧甲基殼聚糖取代度檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，解決了羧甲基殼聚糖取代度測(cè)定時(shí)長(zhǎng)期困擾人們的難點(diǎn)，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，本文根據(jù)文獻(xiàn)[7]，選擇了pH 2.2為第一個(gè)突躍點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了滴定反應(yīng)過程的分析，沒有對(duì)不同取代位點(diǎn)的羧甲基殼聚糖進(jìn)行深入的研究，還需要進(jìn)一步探討。