制備型高效液相色譜法從槐角轉(zhuǎn)化液中純化5,7,8,4’-四羥基異黃酮

鄭丹，彭雯鑫，毛慧淇，沈紅蘭，周學(xué)，張玉千

（南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇泰州 225300）

5,7,8,4’-四羥基異黃酮固體呈微黃色，屬于異黃酮類物質(zhì)，是染料木素的羥基化衍生物。染料木素是一種雌激素樣化合物，被稱為植物雌激素類藥物，醫(yī)藥行業(yè)主要用于治療婦科疾病和老年性骨質(zhì)疏松癥[1]，在抗腫瘤[2]、抗炎、鎮(zhèn)痛、降尿酸[3]、降血脂[4]、體外抗肝纖維化[5]等方面也具有明顯的生物活性。染料木素在人體腸道中吸收，在細胞內(nèi)經(jīng)羥基化生成5,7,8,4’-四羥基異黃酮等代謝產(chǎn)物[6]。5,7,8,4’-四羥基異黃酮是酪氨酸酶的有效抑制劑，具有較強的酪氨酸酶抑制活性[7]，在皮膚色素疾病的治療、食品保鮮及農(nóng)業(yè)抗蟲領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8]。5,7,8,4'- 四羥基異黃酮結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 5,7,8,4’-四羥基異黃酮結(jié)構(gòu)

現(xiàn)有的研究大多從大豆制品中提取分離獲得5,7,8,4’-四羥基異黃酮，如CHANG[9]利用黑曲霉從500 g大豆胚芽固體曲中提取得到了33.5 mg的5,7,8,4’-四羥基異黃酮，收率僅為0.006 7%，且純度未報道?；苯歉缓S酮類化合物，經(jīng)過棘孢曲霉的發(fā)酵轉(zhuǎn)化后，染料木苷和槐角苷等苷類物質(zhì)能被轉(zhuǎn)化為5,7,8,4’-四羥基異黃酮[10-11]。

高效制備液相色譜具有良好的分離度、靈敏度及較大的樣品通量，是現(xiàn)階段天然產(chǎn)物研究中不可或缺的重要工具[12]。如王大力等[13]利用反相高效液相色譜法從洋蔥中分離得到兩個黃酮類化合物，彭金詠等[14]利用反相制備液相色譜分離白花敗醬草異戊烯基黃酮。

本研究以棘孢曲霉轉(zhuǎn)化槐角原料，利用半制備液相色譜分離純化5,7,8,4’-四羥基異黃酮，對流動相比例、流速等色譜條件進行了優(yōu)化，為從槐角中制備高純度的5,7,8,4’-四羥基異黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

槐角粉（80目），市售；棘孢曲霉（CCTCC M 2011264）由本實驗室篩選。

PDA斜面培養(yǎng)基：土豆200 g、蔗糖20 g、瓊脂18 g，定容至1 L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10%槐角水提液，pH自然。

乙睛、甲醇，HPLC級，德國默克公司；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、磷酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CA-1390-1垂直層流潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；Agilent 6460三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HD-930型組合式恒溫搖床，太倉市博萊特實驗儀器廠；Nexus670型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司；FA1004電子分析天平，上海天平儀器技術(shù)有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；AVANCE NEO 400M核磁共振儀，德國Bruker公司；Agilent 1200半制備型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

將保藏菌種轉(zhuǎn)接至PDA斜面活化，30 ℃培養(yǎng)3 d。向斜面中加10 mL蒸餾水做成孢子懸液，按10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h。取出發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，取上清，用等體積乙酸乙酯萃取。萃取液真空濃縮至干，甲醇重新溶解，用制備液相收集5,7,8,4’-四羥基異黃酮，用分析型高效液相色譜儀檢測分析，冷凍干燥得到固體產(chǎn)品。

1.3.2 色譜條件

分析液相條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A為0.07%磷酸水溶液，流動相B為甲醇-乙腈（12∶30，V∶V）；洗脫程序為0～12 min 32%B，12～20 min 54%B；紫外檢測器波長為260 nm；流速為1 mL/min；進樣量為2 μL；柱溫為25 ℃。

制備液相條件：AQ-C18色譜柱（22 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.07%磷酸水溶液，流動相B為甲醇-乙腈（12∶30，V∶V），55%B線性洗脫；流速7 mL/min；進樣量2 mL；紫外檢測器波長260 nm；柱溫為室溫。

1.3.3 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

分別用化學(xué)顯色反應(yīng)、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）與紅外檢測（IR）、核磁（NMR）對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)分析。

（1）化學(xué)顯色法。將樣品溶于1.0 mL甲醇或乙醇中，加入少許鎂粉（或鋅粉）振搖，滴加4～5滴濃鹽酸，2～3 min內(nèi)（必要時微熱）即可顯色，對照組僅加濃鹽酸。

（2）LC-MS法。ESI離子源，采用正、負離子模式，氮氣為干燥氣體（流速7.0 L/min，330 ℃），噴射器壓力為 5 psi。

（3）IR法。掃描范圍4 000～400 cm-1，溴化鉀壓片法。

（4）NMR法。溶劑為DMSO-d6。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相體系

制備色譜中的有機相（B）為甲醇和乙腈（12∶30）混合溶劑，水相（A）為0.07%磷酸水溶液。結(jié)果表明，流動相中有機相為55%進行線性洗脫時，分離效果較好，所有組分出峰情況與分析型液相色譜相似，便于進行對照，為優(yōu)選條件。

2.1.2 流動相流速

在色譜分析中，流速增加，產(chǎn)物的保留時間減少，制備效率提高，但溶劑用量會增加。相對于分析型液相色譜，制備型液相色譜的流速通常較大，溶劑用量增加的會增加經(jīng)濟負擔(dān)。本實驗分別考察了流速為3 mL/min、5 mL/min、7 mL/min、10 mL/min 時，目標(biāo)物質(zhì)的出峰情況。結(jié)果表明，流速為7 mL/min時，峰型對稱，分離度高，為優(yōu)選條件。

2.1.3 進樣量

為了提高溶劑及色譜柱的利用率，制備色譜柱通常是過載運行，但進樣量過大，柱子的分離效能會下降。根據(jù)產(chǎn)品純度及制備效率綜合考慮，進樣量選為2 mL。

2.1.4 制備色譜條件的最終確定

按上述優(yōu)化之后的制備色譜條件進行重復(fù)進樣，半制備液相色譜圖如圖2所示，目標(biāo)產(chǎn)物的保留時間為15.287 min。收集該餾分，進行分析液相色譜檢測。圖3為純化前的分析液相檢測圖，圖4為餾分的液相檢測圖，產(chǎn)物的保留時間為13.359 min。通過歸一化法計算，純化后產(chǎn)物的純度為96%，雜質(zhì)去除明顯，純化效果良好。

圖2 半制備液相色譜圖

圖3 純化前樣品液相色譜圖

圖4 純化后樣品液相色譜圖

2.2 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化學(xué)顏色反應(yīng)

鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性，鋯鹽-檸檬酸反應(yīng)呈陽性，說明該化合物為黃酮類化合物，在A環(huán)上存在5-OH。

2.2.2 質(zhì)譜檢測

用質(zhì)譜對樣品溶液中主要物質(zhì)進行定性，分子離子峰為分別為309.10（[M+Na]+）和285.20（[M-H]-），該物質(zhì)的分子量為286.15，與目標(biāo)產(chǎn)物分子量（286.24）一致。

2.2.3 紅外光譜檢測

使用溴化鉀壓片法測定樣品的固相紅外圖譜，如圖5所示。其中3 390 cm-1、1 380 cm-1和1 290 cm-1吸收峰為羥基相關(guān)峰；1 670 cm-1處為羰基吸收峰；1 540 cm-1和1450 cm-1處為共軛芳香體系存在的標(biāo)志；900～665 cm-1區(qū)域內(nèi)的幾個峰歸屬于芳環(huán)上的=C-H面外彎曲振動及C=C鍵的面內(nèi)彎曲振動。

圖5 樣品的紅外圖譜

2.2.4 核磁共振檢測

1H-NMR（DMSO-d6）：δ6.25（1H，S，H-6），δ6.79（2H，d，H-3’，5’），δ7.35（2H，d，H-2’，6’），δ8.33（1H，S，H-2），δ8.72（1H，S，OH-8），δ9.54（1H，S，OH-4’），δ10.52（1H，S，OH-7），δ12.34（1H，S，OH-5）。

在化合物的1H-NMR譜中，化學(xué)位移δ12.34、δ10.52、δ9.54、δ8.72處的單峰分別是由5-OH、7-OH、4’-OH上的質(zhì)子產(chǎn)生。δ6.79和δ7.35處的雙峰分別是由3’,5’-H和2’,6-H處的吸收峰產(chǎn)生，與文獻一致[15]。

3 結(jié)論

本實驗利用棘孢曲霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化槐角浸提液，將槐角苷、染料木苷等黃酮苷轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，利用半制備高效液相色譜法分離純化產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為5,7,8,4’-四羥基異黃酮，分子式為C15H10O6。半制備高效液相色譜的操作條件為：色譜柱AQ-C18（22 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.07%磷酸水溶液，流動相B為甲醇-乙腈（12∶30，V∶V），洗脫方式為55%B線性洗脫；流速為7 mL/min；進樣量為2 mL；檢測波長260 nm。在該條件下可得到純度為96%的固體產(chǎn)品。

本文利用半制備高效液相色譜法純化得到5,7,8,4’-四羥基異黃酮，具有高效、快速、純化效果好的特點，為制備該物質(zhì)提供了新的途徑。但是該方法也存在溶劑用量大、設(shè)備要求高、色譜柱損耗大的缺點，大批量制備物質(zhì)時成本較高，在后續(xù)的研究中，可以繼續(xù)對該方法進行優(yōu)化。