生物補片中十二烷基硫酸鈉殘留量檢測方法的建立及驗證

肖莉，陳雄偉，李輝

（愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司，北京 101204）

生物補片是將生物來源的組織利用物理、化學(xué)和生物技術(shù)（如經(jīng)過固定、交聯(lián)及除抗原等一系列技術(shù)）改造后，形成的可植入以支持組織或器官的補片[1]。其主要成分是蛋白質(zhì)，包括形成細胞外基質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白及糖蛋白、黏蛋白等，可用于填補受損部位，誘導(dǎo)組織再生[2-3]，是治療臨床組織損傷的理想方法[4-5]。

在部分生物補片的生產(chǎn)過程中會使用十二烷基硫酸鈉（SDS），以達到除去雜蛋白的目的。SDS作為表面活性劑，當(dāng)其到達一定濃度會產(chǎn)生細胞毒性[6]、造成皮膚紅腫[7]、產(chǎn)生溶血作用[8]，因此為了降低產(chǎn)品在使用過程中的安全風(fēng)險，需要控制SDS的殘留量。目前，常見的SDS殘留的檢測方法中使用的溶劑為水，沒有考慮到生物補片中SDS洗脫或浸提的難度[9-10]。生物補片屬于醫(yī)療器械，目前檢測醫(yī)療器械中SDS殘留量的方法尚無相關(guān)的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)的文獻報道，本試驗建立了生物補片中十二烷基硫酸鈉（SDS）殘留量的檢測方法，并依據(jù)《方法學(xué)驗證指導(dǎo)原則》[11-12]對該方法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物補片（20180701、20180901、20181101），愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司；十二烷基硫酸鈉，分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯仿，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；亞甲基藍，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉，分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平，德國Sartorius公司；IS-RDV1恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機，湖南易達京華儀器有限公司；M4多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液制備

亞甲基藍溶液：取亞甲基藍25 mg，無水硫酸鈉5 g，加100 mL純化水使溶解后，加濃硫酸1 mL，混勻。

甲醇-碳酸鈉溶液：取甲醇與10 mmol/L碳酸鈉溶液按照體積比（1∶1）混合。

1.3.2 樣品預(yù)處理

生物補片屬于植入性醫(yī)療器械，參照《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分：樣品制備與參照樣品》[13]中規(guī)定，將供試品剪碎，加入甲醇-碳酸鈉溶液適量，在37 ℃，150 r/min條件下浸提，取浸提液1 mL作為供試品溶液。

1.3.3 檢測波長驗證

取SDS適量，精密稱定，用甲醇-碳酸鈉溶液稀釋制成10 μg/mL、6 μg/mL、2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.4”項下方法處理后，分別在可見光區(qū)（350～750 nm）進行全波長掃描，同法用甲醇-碳酸鈉溶液作空白對照。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取SDS適量，置于容量瓶中，用甲醇-碳酸鈉溶解并稀釋成每1 mL中含10 μg/mL SDS的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 μg/mL SDS的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于離心管中，加甲醇-碳酸鈉溶液至1.0 mL，制成SDS標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

在SDS標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中分別加入1 mL亞甲基藍溶液，充分混勻，然后加入6.0 mL氯仿，充分萃取后，以2 000 r/min離心5 min，吸棄溶液上層。在保留有溶液下層的每一試管中加入無水硫酸鈉（約1 g，不定量），即刻混勻后，以2 000 r/min離心5 min。用吸管吸取試管內(nèi)澄清溶液在651 nm波長處測定OD值，注意勿攪動試管底部沉淀的硫酸鈉晶體。

以溶液濃度對吸光度值進行線性回歸，得回歸方程。連續(xù)4日分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

另精密稱取SDS適量，用甲醇-碳酸鈉溶液稀釋制 成 40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、8 μg/mL、6 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL 和 0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL溶液按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項下方法操作，考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。

1.3.5 重復(fù)性考察

取同一批樣品按照“1.3.2”項下方法制備6份供試品，按照“1.3.3”項下方法操作。

1.3.6 準(zhǔn)確度考察

取已知SDS殘留量的補片樣品，按限度的100%濃度加入一定量的SDS，按“1.3.3”項下方法操作，計算回收率。

1.3.7 溶液穩(wěn)定性考察

取同一批樣品按照“1.3.2”項下方法制備供試品，按照“1.3.3”項下方法操作，分別在0 h、2 h、4 h、6 h和8 h測定吸光度。

1.3.8 樣品中SDS殘留量測定

取3批生物補片，按照“1.3.2”項下方法制備供試品，按照“1.3.3”項下方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長驗證

在可見光區(qū)（350～750 nm）進行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)十二烷基硫酸鈉與亞甲基藍染色液反應(yīng)后形成的藍色物質(zhì)從350 nm開始，吸光度逐漸增大，在（651±2）nm波長處有最大吸收值，文獻[14]中檢測波長十二烷基硫酸鈉與亞甲基藍染色液反應(yīng)后形成的藍色物質(zhì)在650 nm處有最大吸收值，測得的最大吸收波長稍有不同，可能為所用設(shè)備的廠家不同導(dǎo)致，但二者的最大檢測波長相差較小，可認為結(jié)論基本一致。因此本方法采用的檢測波長（651 nm）是合適的。

圖1 SDS標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長掃描圖（350～750 nm）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖2所示，以溶液濃度對吸光度值進行線性回歸，得回歸方程為y=0.049 2x+0.341 5，R=0.999 1，在0.0～40.0 μg/mL線性關(guān)系良好，本法標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍較寬，適用范圍較廣。

圖2 SDS標(biāo)準(zhǔn)曲線

連續(xù)4日的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果見表1。本法用于測定SDS含量，在0.0～11.0 μg/mL線性關(guān)系良好（R＞0.99），連續(xù)4日的線性結(jié)果相似（線性系數(shù)統(tǒng)計學(xué)上無差別，P＞0.05），剩余標(biāo)準(zhǔn)殘差基本一致。這些結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線對測試環(huán)境（如溫度、濕度）的要求較低，重復(fù)性和耐用性良好。

表1 SDS標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 重復(fù)性考察

取同一批補片樣品進行重復(fù)性考察，結(jié)果如表2所示。重復(fù)6次測定結(jié)果的平均值為1.24 μg/mL，RSD為1.5%，說明本方法用于生物補片中SDS殘留量的重復(fù)性良好。生物補片可作為醫(yī)療器械，應(yīng)用于神經(jīng)外科腦膜修復(fù)、食管癌切除之后修復(fù)，顱骨修復(fù)，另外在整形美容以及大面積燒傷的患者、婦科以及腫瘤等領(lǐng)域都有一定的使用[2]。動物源材料本身存在一定的薄厚差異，經(jīng)過化學(xué)處理后，網(wǎng)絡(luò)纖維結(jié)構(gòu)可能不同，厚度也可能不同[7]，從而可能造成SDS殘留在不同位置的殘留也不一樣。如果生產(chǎn)工藝不能得到很好的控制，則同批補片中SDS的含量差異將會較大。實際工作中發(fā)現(xiàn)，較厚的補片比較薄的補片中殘留的SDS多，厚度相差越大，SDS殘留差異越明顯，甚至?xí)_到5倍以上的差異。實驗結(jié)果顯示，本批補片的6份樣品結(jié)果差異小，反映出生產(chǎn)工藝控制較好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確度考察

按照限度濃度100%加入SDS后對本法的準(zhǔn)確度進行研究，結(jié)果如表3所示。6份加標(biāo)樣品的回收率分別為104.7%、102.5%、101.9%、105.6%、104.3%和102.5%，平均回收率為103.6%，RSD為1.4%，表明本方法準(zhǔn)確度良好，測得的結(jié)果可信度高。供試品處理過程中的浸提介質(zhì)選擇十分重要，由于補片存在纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，SDS更容易吸附與蛋白質(zhì)結(jié)合，如果單純用水或者碳酸鈉溶液浸提，通過延長浸提時間或者增加浸提次數(shù)，SDS依然不能被完全浸提出來，會造成檢測結(jié)果偏低的現(xiàn)象。本實驗采用甲醇-碳酸鈉溶液為浸提介質(zhì)進行浸提，在甲醇和碳酸鈉溶液的共同作用下，可以使SDS從與蛋白質(zhì)的結(jié)合中游離出來，并盡量消除靜電吸附或者表面張力等的作用而使SDS在浸提富集的過程中重新與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使檢測結(jié)果更為可靠。

表3 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.5 溶液穩(wěn)定性考察

將供試品溶液于室溫放置8 h，吸光度無顯著變化，SDS含量變化不大，RSD為0.7%，表明供試品溶液于室溫放置8 h仍處于穩(wěn)定狀態(tài)，具體結(jié)果見表4。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 樣品中SDS殘留量測定

經(jīng)測定，3批生物補片中SDS的殘留量分別為1.36 μg/mL、1.44 μg/mL 和 1.25 μg/mL。動物源性的原料本身存在厚薄不均一性，不同個體間也存在較大的差異[7]，因此對處理工藝的要求較高[15-16]，生物補片中的SDS殘留量均一性可以從側(cè)面表征工藝的穩(wěn)定性。本實驗3批產(chǎn)品中SDS的殘留量較為相近，反映生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

由于生物補片與SDS結(jié)合的化學(xué)鍵比較牢固，難以從生物組織中清洗去除，容易殘留在組織中[9-10]，因而不能檢出全部的SDS殘留；用氫氧化鈉或硫酸降解生物補片會使SDS發(fā)生不可逆的化學(xué)變化，因此不能使用直接檢測SDS殘留的方法（亞甲基藍法）[14]；用鹽酸降解生物補片時，由于降解液中含有大量的氯化物，其會與亞甲基藍作用，生成可溶于氯仿的藍色絡(luò)合物[17]，致使測定結(jié)果偏高，不能準(zhǔn)確反映SDS的殘留量。本試驗中采用甲醇-碳酸鈉混合液作為浸提介質(zhì)，碳酸鈉所帶的負電荷可以競爭性的與生物補片中的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而將SDS替代，使其游離出來，而甲醇可產(chǎn)生界面聚集，能夠加速SDS的游離。

本文建立了生物補片中十二烷基硫酸鈉（SDS）殘留量的檢測方法，采用甲醇-碳酸鈉混合液作為浸提介質(zhì)，通過方法驗證對SDS殘留量檢測方法的檢測波長、線性范圍、重復(fù)性、準(zhǔn)確度以及穩(wěn)定性等方面進行了考察。結(jié)果表明本方法用于生物補片中SDS殘留量檢測靈敏、準(zhǔn)確可靠。此外，該方法采用浸提法對樣品進行處理，符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分：樣品制備與參照樣品》中規(guī)定，具有普遍適用性，因此對于各類醫(yī)療器械、生物制品等產(chǎn)品中SDS殘留量的檢測均具有參考價值。