卡瓦提取物DCR516體外舒緩機理研究

張博文，白海沈，薛西峰

（西安綠天生物技術(shù)有限公司，陜西西安 710000）

敏感性皮膚概念最早是由化妝品行業(yè)提出的，是指皮膚在受到物理、化學(xué)等外在因素或精神等內(nèi)在因素刺激下，面部皮膚出現(xiàn)灼熱、瘙癢、緊繃感等癥狀，并呈現(xiàn)出紅斑、毛細(xì)血管擴張等特征。根據(jù)2017年《中國皮膚性病學(xué)雜志》所公布的數(shù)據(jù)，歐洲敏感性皮膚人群占25.4%～89.9%，美洲占22.3%～50.9%，我國女性的敏感性皮膚人群大約占36.1%[1]。由此可見，敏感性皮膚在世界各國都屢見不鮮。

卡瓦提取物是胡椒科植物卡瓦（Piper excelsum）的干燥根提取物，廣泛分布于波利尼西亞、斐濟、瓦努阿圖等南太平洋島國，其根與根莖皆可入藥，有著放松肌體、抗真菌、鎮(zhèn)痛、緩解緊張且毒副作用小等優(yōu)點，其提取物具有顯著的催眠、即時鎮(zhèn)痛止癢、抗菌等多種類型的藥理功效[2]。美業(yè)研究院統(tǒng)計，在2021年第二季度我國國家藥品監(jiān)督管理局的備案增長量排行榜中，卡瓦胡椒根提取物在舒敏領(lǐng)域排名第一，位居整個植物類提取物第二[3]。由此可見，卡瓦提取物備受化妝品行業(yè)的青睞。

斑馬魚（Danio rerio）是一種主要分布于巴基斯坦、緬甸、印度、孟加拉等地的熱帶淡水魚，因其體積小、養(yǎng)殖方便、繁殖周期短等優(yōu)點，被廣泛用于科學(xué)研究中。除此之外，斑馬魚還具有與人類基因、皮膚結(jié)構(gòu)以及免疫系統(tǒng)較高同源性與相似性的特點，因此是相關(guān)行業(yè)產(chǎn)品功效實驗及評價的首選替代實驗品[4]。本文通過卡瓦提取物DCR516在斑馬魚模型上進行初步的緩解刺激實驗，進而探究DCR516對辣椒素受體，即TRPV1的舒緩功效，為護理行業(yè)能夠更好地使用卡瓦提取物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基纖維素（貨號M0512），德國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO，貨號D4540），德國Sigma公司；冰乙酸（批號I1712010），阿拉丁試劑(上海)有限公司；阿司匹林（批號J1910024），阿拉丁試劑（上海）有限公司，用100%的二甲亞砜（DMSO）制作成濃度為10 mg/mL的母液，于-20 ℃保存；在實驗開始前用養(yǎng)魚專用水制作成1%的冰乙酸母液，按需稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。卡瓦“DCR516”，白色粉末，西安綠天生物技術(shù)有限公司出品，陰涼柜避光保存，用ddH2O配制成20 mg/mL母液，于-20 ℃凍存。KC2500（批號2211061），廣東博溪生物科技有限公司；PBS（0.01 mol/L），美國博士德公司；TRPV1抗體，分析純英國Abcam公司；多聚甲醛，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SMZ645解剖顯微鏡，日本Nikon公司；VertA1型CCD相機，上海土森視覺科技有限公司；CP214型精密電子天平，美國Ohaus公司；videotrack3.3行為分析儀，法國ViewPoint公司；150i CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DM2500熒光顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 實驗動物

選取240尾經(jīng)自然配對繁殖受精產(chǎn)出兩天（2dpf）的AB型野生斑馬魚，每30尾為一個實驗組，用于確定“DCR516”緩解刺激功效的最大檢測濃度（MTC）；選取180尾經(jīng)自然配對繁殖受精產(chǎn)出兩天（2dpf）的AB型野生斑馬魚，每30尾為一個實驗組，用于“DCR516”緩解刺激功效的評價。將上述所有斑馬魚實驗組飼養(yǎng)在溫度為28 ℃的養(yǎng)魚專用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中配備200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm；pH為6.8～7.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3），實驗斑馬魚的使用許可證號為SYXK（浙）2012-0171，符合國際AAALAC認(rèn)證的飼養(yǎng)管理要求。

1.4 實驗方法

1.4.1 DCR516最大耐受濃度實驗

在六孔板中放入隨機篩選出的正常AB型野生斑馬魚（產(chǎn)出2 d），每孔放入30尾斑馬魚，容量為3 mL，分別在水中溶解“DCR516”制備成31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL、1 000.00 μg/mL 和 2 000.00 μg/mL實驗組，不添加為對照組，共8組。各組分別處理24 h后，觀察和記錄每組斑馬魚的毒性表型和死亡數(shù)量，確定“DCR516”的最大耐受濃度（Maximum Talerated Concentration，MTC）。

1.4.2 DCR516緩解刺激功效評價

在六孔板中放入隨機篩選出的正常AB型野生斑馬魚（產(chǎn)出2 d），每孔放入30尾斑馬魚作為實驗組，其容量為3 mL，分別水溶給予222 μg/mL、667 μg/mL、2 000 μg/mL“DCR516”；設(shè)置濃度為50 μg/mL的阿司匹林藥品為陽性對照組，同時設(shè)置與其相對應(yīng)的養(yǎng)魚用水斑馬魚正常對照組以及模型對照組（在正常養(yǎng)魚用水的基礎(chǔ)上用冰乙酸建立疼痛模型），共6組。

各組分別處理24 h后，從每個斑馬魚組別中隨機篩選出10尾斑馬魚放入96孔板中，每孔1尾，每孔100 μL。除正常對照組外，其余實驗組均水溶給予0.009%冰乙酸建立斑馬魚疼痛模型，利用行為分析儀檢測0.5 h內(nèi)斑馬魚總運動距離（D，mm），以總運動距離評價“DCR516”對斑馬魚的緩解刺激功效。緩解刺激功效按式（1）計算。

判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)緩解刺激功效＜20%或P＞0.05時，其緩解刺激效果不顯著；當(dāng)功效≥20%且P＜0.05時，其緩解刺激效果顯著。

1.4.3 DCR516對辣椒素受體的舒緩功效測試

1.4.3.1 測試目的及原理

敏感性皮膚是一種主要表現(xiàn)在面部皮膚的高反應(yīng)狀態(tài)。而TRPV1為門控離子通道受體，是一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中的多相受體，因與皮膚的灼熱、疼痛都有密切關(guān)系，也稱為辣椒素受體，是一種熱敏感受體[4]。本測試的原理是基于TRPV1可以被各種配體直接或間接激活，從而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量升高，觸發(fā)動作電位。本文測試的目的是通過辣椒素刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，激活TRPV1，進一步導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，然后經(jīng)過待測物作用后，通過檢測TRPV1蛋白含量來評價待測物是否通過抑制TRPV1和Ca2+內(nèi)流而達(dá)到舒緩的功效[5]。

1.4.3.2 測試過程

（1）細(xì)胞接種。將角質(zhì)形成細(xì)胞按1.8×105個/孔的接種密度移到6孔板，并放入恒溫37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。

（2）工作液配制。分別配制受試物工作液。

（3）給藥。根據(jù)表1的測試方案，待6孔板中細(xì)胞鋪板率接近40%～50%時，進行分組給藥，每孔給藥量為2 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，給藥完成后將6孔板放置在同樣條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h。

表1 實驗設(shè)計方案

1.4.3.3 TRPV1檢測

用4%的多聚甲醛對細(xì)胞進行固定處理，固定30 min后，進行辣椒素受體（即TRPV1）的免疫熒光檢測，然后根據(jù)顯微鏡下采集到的數(shù)據(jù)，進行觀察分析。

1.4.3.4 SAS數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism繪制作圖，各試驗分組之間的采用t-test進行統(tǒng)計比較分析，統(tǒng)計分析均為雙尾，結(jié)果用Mean±SD表示，若P＜0.05，則認(rèn)為具有顯著差異，若P＜0.01則認(rèn)為具有極顯著差異[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大耐受濃度（MTC）實驗結(jié)果

與對照組養(yǎng)魚用水中的AB型斑馬魚相比，在給予濃 度 為 31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL、1 000.00 μg/mL 和2 000.00 μg/mL的“DCR516”時，各個實驗組毒性表型未見明顯異常，AB型斑馬魚死亡率為0%，最大耐受濃度為2 000.00 μg/mL。

2.2 緩解刺激功效

由表2和圖1可知，模型對照組的斑馬魚運動總距離遠(yuǎn)大于正常對照組，說明模型建立可行。其中DCR516組的斑馬魚運動總距離在濃度為667 μg/mL時最短，同時其緩解刺激功效達(dá)到了33%，大于23%（最大檢測濃度2 000μg/mL下的緩解刺激功效），表明卡瓦提取物DCR516對斑馬魚模型具有緩解刺激作用且功效顯著。

表2 各實驗組處理后斑馬魚總運動距離（n=10）

圖1 “DCR516處理后斑馬魚行為軌跡圖”

2.3 DCR516對辣椒素受體的舒緩功效分析

TRPV1檢測結(jié)果及熒光圖如表3、圖2所示。

圖2 TRPV1免疫熒光結(jié)果圖

表3 TRPV1檢測結(jié)果匯總表

與BC組相比，NC組的TRPV1蛋白含量顯著上升，且其熒光圖中NC組的熒光部分明顯多于BC組，說明本次測試刺激條件有效；與NC組相比，PC組的TRPV1蛋白含量顯著下降，其熒光圖中的熒光部分也與表中結(jié)果一致，說明本次陽性對照檢測有效；與NC組相比，樣品DCR516在濃度為781 μg/mL時，TRPV1蛋白含量顯著下降，蛋白表達(dá)量下調(diào)了28.3%，與熒光圖中樣品DCR516的熒光部分明顯低于NC組得出的結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

根據(jù)卡爾提取物DCR516對斑馬魚模型的緩解刺激功效評價，證明了DCR516具有舒緩作用；再基于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，通過對辣椒素受體TRPV1的舒緩功效測試，得出樣品卡爾提取物DCR516確實能夠通過抑制TRPV1蛋白的表達(dá)而達(dá)到舒緩的功效。