化學品風險評估新技術方法的發(fā)展及應用

賈 栗，范瑞棋，，張婉君，，陳義強，苑曉燕

（1.解放軍疾病預防控制中心，北京 100071；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

傳統(tǒng)的化學品風險評估測試主要以動物模型為研究對象，隨著實驗動物3R原則的不斷深入實施，以及2007年美國國家科學院開創(chuàng)性文件《21世紀的毒性測試：愿景與策略》（Tox21）和2009年《科學與決策：推進風險評估》的發(fā)表，再到2019年美國環(huán)境保護署（Environmental Protection Agency，EPA）發(fā)布將于2035年停止進行或資助針對哺乳動物開展的研究均表明，近20年來，毒理學測試方法已從傳統(tǒng)的動物實驗轉向非動物替代方法的開發(fā)和運用。新的化合物不斷涌現(xiàn)，替代方法產(chǎn)生了大量體外測試數(shù)據(jù)，迫切需要開發(fā)快速高效的用于化學品風險評估的新技術方法（new approach methodologies，NAM）[1]。美國EPA 在 2018年定義了NAM的范圍：包括各種非動物新技術、替代策略、理想的預測模型及大量化學危害和風險評估產(chǎn)生的相關數(shù)據(jù)和信息。這些新數(shù)據(jù)復雜且多樣化，來自高通量測試、毒代動力學測試、分子流行病學、組學技術、暴露科學、計算化學和新動物模型等[2]。NAM目前主要應用于快速高效地識別化學品的危害特征并收集劑量反應數(shù)據(jù)，對大量的化學品進行優(yōu)先順序排列，從中篩選出需要深入測試評估的化學品，大大提高了化學品風險評估的效率。NAM的大規(guī)模開展和實施為化學品的危害表征和風險評估提供了適合的科學基礎，為更多與人類相關的安全評估提供信息。本文就目前國內外開發(fā)的NAM及其在化學品風險評估方面的應用、NAM整合測試策略、存在問題等方面進行綜述，為我國化學品風險評估NAM的開發(fā)及應用提供參考。

1 適用于化學品風險評估的NAM

為了應對不斷涌現(xiàn)的化學品風險評估及大量的信息整合處理工作，多種NAM應運而生。目前國內外比較關注的用于化學品風險評估的NAM主要有計算方法學、體外測試策略和體外生物動力學等。

1.1 計算方法學

計算方法學是近年來毒理學非?；钴S的研究領域，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。幾乎所有的毒理學研究和風險評估都使用了計算機工具，其中包括龐大的化學品毒理學特征數(shù)據(jù)庫、用于模擬生物系統(tǒng)和分子動力學的計算機模型以及用于預測毒性的建模軟件[3]等。

交叉參照（read-across）NAM應用最廣泛的是填充化學品危害特征及風險評估中的數(shù)據(jù)空白。交叉參照是一種數(shù)據(jù)填充技術，可用一些化學品的終點信息數(shù)據(jù)來預測另一種（一類）具有相似特性的化學品的終點信息，可免除目標物質的體內試驗，具有速度快、費用低的特點[4]。其作為非測試方法中的重要策略已被歐盟和美、加、日等多國的管理機構所接受，在我國《新化學物質申報登記指南》中也被認可[5]。目前已開發(fā)并使用的交叉參照模型主要有OECD QSAR Toolbox，Toxmatch和ToxRead等。歐盟EU-ToxRisk項目開發(fā)了特定的交叉參照案例評估這種方法的適用性，如通過使用計算數(shù)據(jù)進行化學品危害表征，通過基于生理的毒代動力學模型（physiologically based toxicokinetic，PBTK）解決化合物的動力學/生物利用度在人體的差異性等[6]。如用類似物的已知毒性數(shù)據(jù)來預測2-乙丁酸90 d重復毒性試驗，通過有害結局路徑（adverse outcome pathway，AOP）框架網(wǎng)絡確定脂肪肝變性的關鍵分子事件，并用相應的體外測試來支持交叉參照的假設，通過證據(jù)權重方法輔助分析不確定性，然后進行人體等效劑量的計算，以推導出風險評估的起點（point of departure，PoD）。另有案例選擇一系列具有體內發(fā)育毒性的2-甲己酸類似物來預測2-甲己酸的生殖發(fā)育毒性，并用斑馬魚胚胎實驗、小鼠胚胎干細胞實驗、基于誘導多能干細胞神經(jīng)發(fā)育模型和PBTK模型等進行測試，探討類似物是否能準確預測各自的體內發(fā)育毒性，進一步探討結構與發(fā)育的關系。有研究者使用基于化學結構分析和近百萬個化學性質危害數(shù)據(jù)開發(fā)的交叉參照模型對9個化合物危害終點進行分類，準確度達到70%～95%[7]。交叉參照已被廣泛用于預測復雜毒性和不良反應。然而，交叉參照的可靠性值得進一步規(guī)范，需要整合多個NAM測試結果來驗證，因此需要更復雜的預測模型或證據(jù)權重評估程序來整合相關信息。

1.2 體外測試方法

高通量轉錄組學（high-throughput transcriptomics，HTTr）篩查技術是較早開展的體外替代方法，在2007年發(fā)布的《21世紀的毒性測試：愿景與策略》中就明確了開發(fā)和利用人類細胞體外模型，開發(fā)基于通路的與毒性和計算機模型相關的細胞檢測方法。隨著高通量技術的發(fā)展，轉錄組學技術已被生物醫(yī)學領域廣泛運用。早期轉錄組學技術用于研究化學暴露下基因組水平擾動，為化學品毒性作用模式（modes of action，MOA）及分類提供支持。近年來，劑量依賴HTTr的應用為化學品早期篩選提供了更加全面和高效的方法，可支持計算生物信號通路發(fā)生擾動的PoD。有人提出，基于HTTr數(shù)據(jù)的劑量反應模型可被納入風險評估框架，作為化學品危害評估的一種手段[8]。隨著HTTr的不斷應用和發(fā)展，科學家們在此基礎上開發(fā)出更多新穎的、適用性強的方法進行化學品危害評估。Harrill等[9]以MCF-7細胞為模型，采用測序讀出模板核苷酸（TempO-Seq）分析方法對44種環(huán)境化合物進行HTTr分析，并開發(fā)了一種新的基于基因表達特征的劑量反應建模方法，以確定基因表達開始出現(xiàn)擾動的閾值。TempO-Seq技術特點在于與細胞裂解物相容性較好、無需額外RNA純化、僅需皮克量RNA就能生成多重測序文庫，適用于高通量環(huán)境化學品危害評估。我國學者新開發(fā)的劑量依賴的人簡化轉錄組學（human reduced transcriptomics，RHT）方法可評估基于通路擾動的單一化學品，并開發(fā)了基于單一化學品預測模型的混合物的基準效應評估方法，這種方法可對環(huán)境化學物/混合物干擾的生物信號擾動進行定性和定量評估[10]。另有研究者用大型公共毒理基因組數(shù)據(jù)庫（TG-GATEs）已發(fā)表數(shù)據(jù)開發(fā)了一個基于web的交互式瀏覽器MoAviz，通過可視化方式展示化學品擾動的信號通路，為識別化學品毒作用模式提供了系統(tǒng)框架[8]。體外轉錄組學技術會產(chǎn)生大量復雜數(shù)據(jù)集，如何收集、評估和解釋轉錄組學數(shù)據(jù)具有非常大的挑戰(zhàn)性，如如何實現(xiàn)可視化和解釋數(shù)據(jù)、如何選擇細胞和組織，需要測試細胞或組織的數(shù)量、是否需要增加其他測試以獲得更具生物學相關性的代表性數(shù)據(jù)等[8]。針對上述問題，美國EPA以MCF-7細胞為模型，使用全細胞轉錄組學對1000多種化合物進行劑量-效應評估的案例及Tox21中高通量轉錄組學項目的研究案例，均可提供有價值的參考[11-12]。隨著基于組學的NAM的發(fā)展，這些都是需要進一步探討的問題。

微生理系統(tǒng)（microphysiological system，MPS）有時也被稱為器官芯片或人體芯片，是指在芯片上構建的器官生理微系統(tǒng)，它以微流控芯片為核心，結合細胞生物學、生物材料和工程學等多種方法，在體外模擬構建多種組織器官微環(huán)境。這種微縮的組織器官模型可在體外接近真實地重現(xiàn)人體器官的生理、病理活動，預測人體對外界刺激的反應，成為近年來發(fā)展迅速的前沿科學。美國于2011年率先啟動人體芯片（human-on-chip）計劃后，歐洲部分國家也紛紛開展了器官芯片的研究項目[5]。MPS模型包括潛在的生物學和毒理學AOP中的關鍵事件，可提供與化學品安全評估相關的信息[13]。如“微型大腦”或大腦類器官是原代細胞或誘導多能干細胞的3D培養(yǎng)物，可定向發(fā)育成神經(jīng)組織，并應用于人腦組織的藥物毒性研究[14-15]。目前正在開發(fā)能模擬體內肺結構的人源體外組織培養(yǎng)物如體外氣液界面細胞培養(yǎng)模型，用于評估一些吸入毒理學終點[16]。但這些方法還在發(fā)展初期，需要進一步改進和驗證[17-18]。此外，腸細胞類器官和體外腎小管樣結構組織也已建立，這些體外技術雖還不能完全重現(xiàn)這些器官的復雜性，但依然可進行一些毒性評價探索，同樣需要進一步優(yōu)化和驗證[19-20]。MPS模型的開發(fā)已逐漸從單器官模型向相互關聯(lián)的多器官模型邁進[21-22]，“人體芯片”是一種多通道的3D微流控細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，劃定特定的微環(huán)境、3D細胞聚集培養(yǎng)模擬體內多個器官，從而設計一個全身的仿生裝置[23]。但目前的MPS模型還存在技術壁壘，包括但不限于無法合理重現(xiàn)器官系統(tǒng)之間的相互作用、未能適當模擬藥物在體內的藥動學過程、無法評估長期暴露的毒性效應和無法基于體外暴露藥物濃度來準確估計人體劑量等?；赑BTK研究建模和體外-體內外推（in vitro-in vivoextrapolation，IVIVE）方法可嘗試解決這些問題。

1.3 體外生物動力學方法

生物動力學NAM主要包括體外方法（優(yōu)選使用人體組織試驗材料或細胞）、計算（計算機）方法，及兩者的組合。如使用人結直腸癌細胞Caco-2、犬腎細胞MDCK或豬腎細胞LLC-PK1研究腸道吸收和轉運蛋白；使用人造皮膚用于皮膚吸收研究；使用人胚胎絨毛癌BeWo細胞建立代謝模型，開展人體血漿蛋白結合測定及胎盤轉運試驗等[24-25]。器官芯片模型也是最新研究熱點，通過更好的生理相似性及在一個平臺內整合不同器官的方法提高檢測準確性[26-29]。計算方法（模型）主要有基于生理學的動力學（physiologically based kinetic，PBK）和基于生理學的藥動學（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）模型[30-32]。如使用人體細胞或組織體外實驗數(shù)據(jù)與計算機技術結合，使用計算分配系數(shù)，以參數(shù)化PBPK模型來預測人體生物動力學[30，33]。生物動力學技術將在下一代毒性測試中發(fā)揮重要作用，用于生物動力學的NAM將在體外毒性實驗設計中發(fā)揮關鍵作用。

化學物質的毒代動力學（毒動學）參數(shù)在人體和動物間差異顯著，需要發(fā)展以人為基礎的體外模型，從而有效預測化學物質的人體危害。因此PBPK模型應運而生，其是根據(jù)機體解剖學和生理學知識，按照臟器（如肝和腎）解剖學結構或組織（如脂肪和肌肉）類型等進行分區(qū)的生物動力學模型。主要用于綜合預測化合物的吸收、分布、代謝和消除過程及體內毒性。預測器官組織中化合物濃度、代謝產(chǎn)物的變化過程和化合物毒性劑量在動物種屬中的外推。在制藥領域，PBPK模型在人體用藥初始劑量選擇和藥物相互作用預測中被廣泛應用。

在毒理學領域，PBPK模型主要作用是將受試化合物的體外數(shù)據(jù)推到人體內，也叫做定量IVIVE。有學者采用體外肝微粒體孵化和Caco-2轉運研究中獲得的計算機衍生參數(shù)和生物動力學數(shù)據(jù)開發(fā)了基于PBPK模型的NAM，通過反向劑量法預測草藥生物堿伊波加因堿（ibogaine）及其代謝產(chǎn)物降伊波加因堿（noribogaine）的人類心臟毒性，同時也驗證了這種NAM的適用性[34]。

2 NAM在化學品風險評估中的應用

近年來，多種NAM已廣泛應用于高通量化學品風險評估中，并取得了很好的效果。而關于混合化學物或復雜化學物的風險評估，NAM的應用才剛起步，并且逐漸成為關注的焦點。

2.1 環(huán)境混合污染物

目前大部分的風險評估主要針對單一化學品，但事實上，人類在環(huán)境或職業(yè)中往往同時暴露于多種化學物，而它們之間的相互作用可能會導致暴露風險復雜化[35]，因此，混合物的風險評估面臨重大挑戰(zhàn)。濃度加和（concentration addition，CA）和獨立作用（independent addition，IA）模型預測是目前常用的混合物風險評估方法[36]，但這種模型預測具有一定的不適用性和不確定性。而使用NAM測試策略進行混合物風險評估可能會更好的降低混合物暴露對健康影響的不確定性[37]。Hsieh等[38]采用人體多能干細胞誘導的肝細胞、心肌細胞、內皮細胞、神經(jīng)元細胞和臍靜脈內皮細胞5種體外模型，對42種單一環(huán)境污染物及其8種混合物進行體外細胞毒性測試，構建濃度-反應關系，再用貝葉斯概率方法進一步模擬上述環(huán)境污染物暴露-效應模式的可能性；同時采用CA和IA模型預測混合物的聯(lián)合毒性效應，并與實際檢測的結果進行比較。結果表明，由“低毒”或“安全”的單一化合物構成的混合物均表現(xiàn)出顯著的生物活性，盡管CA預測混合物風險比IA更為準確，但在有些情況下，混合物的生物活性遠大于其組分加和的生物活性。當所有成分的數(shù)據(jù)都可用時，CA是預測混合物毒性的首選，但這種預測的準確性因不同的細胞而產(chǎn)生差異，因此在評價復雜混合物聯(lián)合毒性時依然需要結合實際測試數(shù)據(jù)。而NAM則可快速提供大量體外測試數(shù)據(jù)，以用于多種混合物的風險評估，降低混合物風險評估的不確定性，為完善環(huán)境污染物風險評估提供了更多的可能性。

2.2 復雜或未知化學物

最近更新的美國EPA有效有毒物質控制清單（https：//www.epa.gov/tscainventory/how-accesstsca-inventory#download）中大約20%化學品是未知物質、成分可變的物質或復雜反應產(chǎn)物，研究此類復雜物質存在重大挑戰(zhàn)。未知或可變的成分、復雜的反應產(chǎn)物通常包含許多不同的單獨成分，每種成分可能具有不同的物理化學和毒理學特性[39]。而在當前的化學品監(jiān)管制度下很少有既定的評估框架[40]。House等[41]測試了141種石油物質在15種人類細胞類型中的作用，以推導出一套綜合的表型，從而根據(jù)物質的體外生物活性對其進行分組。結果表明，NAM數(shù)據(jù)可用于對單個復雜混合物進行排序，這種方式與基于化學成分預測體內潛在危害的結果高度一致。進一步表明復雜混合物的生物活性分析是表征復雜物質“足夠相似性”的可行途徑，旨在測試是否及如何使用體外生物活性數(shù)據(jù)為復雜混合物分組提供信息。

Wetmore等[42]使用BioMAP分析評估了30種有機種植水果和蔬菜提取物的生物活性，評估了其濃度響應。然后將結果與ToxCast中測試的農(nóng)用化學品結果進行比較，認為這些提取物是安全的。這項研究的結果部分得到了美國化學理事會的長期研究計劃的支持。結果表明：①水果和蔬菜中的化合物影響多個體外毒性終點；②與ToxCast單一化學物質相比，提取物在定性和定量上表現(xiàn)出不同的生物活性特征（可能因提取物是生物活性植物化學物質的復雜混合物）；③劑量反應源于對復雜物質中不同成分的反應疊加；④化學物的生物活性不一定是不良反應，強化了體外生物活性并不等同于一對一的不良健康影響。鑒于此類有益健康的物質在體外會產(chǎn)生多種生物活性，因此在使用高通量毒性測試方法評估危害表征時需要注意[42]。

3 NAM整合測試策略

NAM的種類繁多，發(fā)展迅速，但單一的替代方法有其局限性和適用范圍，不可能建立一對一的替代方法完全替代傳統(tǒng)動物實驗，因此需要將多種NAM及不同來源的信息整合使用，更精準地完成風險評估。關于如何將適用的NAM整合并用于不同目的的風險評估，Andersen等[44]提出了一個方法路線圖（圖1），描述了在不同風險環(huán)境中應用NAM的級別和場景。級別1為計算機篩選。這個層級的NAM可估計化學品物理特征、推斷可能產(chǎn)生的毒性（如QSAR平臺、毒理學關注閾值等）、預測可能的代謝物、并評估在預期使用條件下的暴露情況。目的是利用已知相似屬性化合物信息對新的化學品信息進行數(shù)據(jù)填充，可快速進行大量的化學品篩選。級別2為高通量體外篩查。若在級別1中確定有毒性但未能確定可信的暴露安全閾值，則需要進行級別2的NAM測試。級別2的NAM主要以體外高通量測試為主，主要參考Tox21和EPA的ToxCast中的測試方法。近年來廣泛應用的方法有基于細胞檢測基因表達的HTTr技術[43]，評價細胞形態(tài)學的高內涵成像技術、基準劑量分析和MOA分析的通路可視化方法，如動作可視化軟件MoAviz[44]。理想情況下，2級檢測應針對監(jiān)管終點而定制，明確如何適用于已知的MOA或AOP。使用IVIVE將ADME數(shù)據(jù)與生物活性測定數(shù)據(jù)整合轉換成半數(shù)抑制濃度、人等效劑量值，并與暴露估計值進行比較，生成暴露模式。級別3為目的性更強的檢測和安全性評價。是在級別2基礎上更加精細的暴露評估。預計級別3未來會廣泛應用，可能會使用更復雜的多維或多細胞分析的NAM，比如與人體相關的符合目標的測試（human-relevant fit-for-purpose，F(xiàn)FP）。FFP平臺主要開發(fā)細胞靶向檢測[45]。FFP檢測平臺多種多樣，有復雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，如“迷你大腦”[46]，各種組織的衍生細胞三維培養(yǎng)等檢測平臺等，與高內涵技術集成可同時評估多個毒性終點。級別4為更完整的檢測系統(tǒng)。在高劑量下，化學品在體內動物實驗中動力學呈非線性，且動物與人體的差異性等問題，不能簡單地將體外數(shù)據(jù)推導到體內，因此該層級應設計更加復雜的檢測，包括多細胞和多維檢驗、人類芯片、組織替代物檢測平臺，以檢測代謝物的肝代謝、組織間循環(huán)以及細胞或亞細胞組分代謝物生成[47-48]。一系列平臺整合可進行更綜合的毒性測試[49]，將暴露信息及各種體外測試數(shù)據(jù)與每個級別相結合進行整合評估，可實現(xiàn)更加準確的風險決策。

圖1 新技術方法整合測試策略層次圖[1].QSAR：定量結構-活性關系；HT：高通量；MOE：暴露邊界；IVIVE：體外到體內外推；MOA：作用模式；PBPK：基于生理的藥代動力學.

4 NAM應用中存在的問題及解決方案

NAM已成為全球生物醫(yī)藥大發(fā)展背景下的熱門領域，但多數(shù)情況下，NAM在各國和組織間獨立發(fā)展，可信度的規(guī)則和標準未能得到規(guī)范。在風險評估中使用NAM的障礙是人們無法普遍認可這些新工具和數(shù)據(jù)，解決方案是需要建立評估NAM可信度的方法。針對此問題，美國衛(wèi)生與環(huán)境科學研究所組織多個相關行業(yè)的專家共同提出了一個框架，提供了一套標準來評估NAM的適用性，同時提供了一種系統(tǒng)方法來評估當前可用的NAM，并確定它們對監(jiān)管的適用性。此框架主要包括3個步驟：①確定應用目的。確定NAM是用于優(yōu)先排序、危害識別還是風險評估。②解決核心原則。包括方法的準確性（如假陽性和陰性檢測）、透明度（明確的預測模型和算法等）及了解其局限性和適用范圍。③定義適合用途的標準。包括化學品適用范圍、方法描述、數(shù)據(jù)集質量的驗證、同行評審、預測的終點或途徑、機制說明、穩(wěn)定性測定、數(shù)據(jù)可訪問性、與體內數(shù)據(jù)（動物或人類）的生物學比較、模型的統(tǒng)計評估、預測的確定性水平、生物變異性和關注的亞群等。同時一些已被驗證的應用案例可供研究者們參考借鑒[50]。

5 結語

使用整合的NAM可快速識別化學品毒性，從而更易關注到有潛力的化學品并開展更進一步的風險評估。NAM的使用進一步突出了共享數(shù)據(jù)和方法以及協(xié)調化學品優(yōu)先排序和評估資源的必要性，使得整體化學品風險評估更高效、更精準。

目前，NAM主要應用于化學品的篩選和優(yōu)先排序這類風險評估過程中的早期步驟，未來還將深入應用于風險評估的各個階段。其發(fā)展尚需解決以下問題：①全球化學品安全立法復雜且多樣化，而大部分國家當前法律僅允許和（或）鼓勵少量新技術應用，需要重新思考當前的立法程序，使之足夠嚴謹且適用于新技術規(guī)范。②目前全球數(shù)據(jù)共享不完整，缺乏許多類型的毒理學數(shù)據(jù)和信息，需要各相關行業(yè)開展數(shù)據(jù)共享，不斷優(yōu)化技術和信息學結構，增加數(shù)據(jù)的可用性，做到符合可查找、可訪問、可互操作和可再利用的原則，應鼓勵建立全球可自由訪問的免費的共享數(shù)據(jù)庫。③目前有許多計算機模型和其他一些NAM可用于風險評估，但這些NAM均處于開發(fā)、驗證或接受的不同階段[51]，需要確定哪些方法適用于化學品安全評估，如何開發(fā)更有前途的NAM，以及發(fā)展如何讓NAM達到可接受水平的決策框架。我國的NAM正處于發(fā)展階段，更加需要相關政策的制定和規(guī)范，也需要更多的研究人員投入到該領域中來，使NAM在風險評估方面的應用發(fā)揮更大作用。