柴胡皂苷b2通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子6介導(dǎo)的糖代謝通路減輕二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠原發(fā)性肝癌

有 曼，張 虹，何廣宏，孟 璐，李瑞芳，王紅偉

〔1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）藥學(xué)部，河南 洛陽(yáng) 471000；2.河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽(yáng) 471000〕

肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，是腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過50%的肝癌病例和死亡都發(fā)生在中國(guó)，其嚴(yán)重威脅著國(guó)人的生命健康[2]。原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）按病理亞型主要分為肝細(xì)胞癌（hepatic cellular cancer，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型，這3種病理亞型的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為、組織學(xué)形態(tài)、治療方法和預(yù)后等差異較大。HCC占PLC的85%～90%[3]。臨床常用治療肝癌的藥物主要有多柔比星（doxorubicin，DOX）、五氟尿嘧啶和順鉑等。但這些化療藥物腫瘤細(xì)胞選擇性差，易導(dǎo)致腫瘤中藥物濃度不足、全身細(xì)胞毒性和腫瘤細(xì)胞耐藥性等問題。近年來研發(fā)的新型抗肝癌藥物奧沙利鉑（oxalipatin）和索拉非尼（sorafenib）逐漸展現(xiàn)出各種優(yōu)勢(shì)，然而隨著藥物濃度的累積，其耐藥性也開始逐漸增強(qiáng)，治療有效性逐漸降低[4]。著名的索拉非尼肝細(xì)胞癌評(píng)估隨機(jī)方案（SHARP）試驗(yàn)表明，與安慰劑組相比，索拉非尼可使患者總生存期延長(zhǎng)2.8個(gè)月[5]，然而在6個(gè)月內(nèi)就開始出現(xiàn)耐藥，療效比較有限[6]。近年來越來越多的研究表明，從天然產(chǎn)物中提取的植物藥物在治療包括癌癥在內(nèi)的許多慢性疾病方面表現(xiàn)出了廣闊的潛力。因此，尋找治療肝癌的高效、安全、多靶點(diǎn)的新型抗肝癌藥物顯得尤為重要。

柴胡最早記載在中醫(yī)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中[7]，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，已有兩千多年的歷史。其性味苦、微寒，歸肝、膽經(jīng)，常被用作解表、肝氣郁滯等。近些年柴胡已被用作肝臟保護(hù)藥，主要用于治療各種肝病，如慢性肝炎、病毒性肝炎，甚至肝硬化引起的肝細(xì)胞癌[8]。柴胡皂苷（saikosaponins，SS）是柴胡中的主要生物活性成分，研究發(fā)現(xiàn)，它在體內(nèi)外均具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒和護(hù)肝活性[9]。根據(jù)結(jié)構(gòu)差異，柴胡皂苷可分為柴胡皂苷a（SSa）、SSb1～SSb4和 SSc～SSi[10]。有研究表明，低 pH條件下，包括胃酸或中藥醋炙，會(huì)導(dǎo)致柴胡皂苷成分的轉(zhuǎn)化，主要由SSa向SSb1、SSd向SSb2轉(zhuǎn)化。醋炙柴胡治療肝病更有效、更安全，其中大部分SSd轉(zhuǎn)化為SSb2[11]。目前研究顯示，SSb2具有強(qiáng)大的抗病毒作用，但還缺乏更為深入、廣泛的實(shí)驗(yàn)研究，有必要深入了解其藥理作用，研究柴胡發(fā)揮護(hù)肝以及抗腫瘤功效的有效成分。本研究采用二乙基亞硝胺（diethyl nitrosamine，DEN）制備原發(fā)肝癌模型，探討SSb2在護(hù)肝方面的藥理作用，為開發(fā)新型藥物提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

SSb2（純度＞99%，19032104），成都曼思特生物科技有限公司；DOX（1804E2），深圳萬樂有限公司；DEN（180711），阿拉丁試劑有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate pyruvic transaminase，GPT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子6（silent information regulator 6，SIRT6）和兔抗小鼠丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1）多克隆抗體（一抗），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）單克隆抗體，美國(guó)Affinity Bioscience公司；兔抗小鼠低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）多克隆抗體、兔抗小鼠乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）多克隆抗體、兔抗小鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），武漢博士德生物工程有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京碧云天有限公司；ECL底物液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

GZX-DH-40í45型倒置顯微鏡和Leica RM2128切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；垂直電泳槽、Trans-blot電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，北京六一公司；高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 動(dòng)物、造模、分組和給藥處理

60只健康雄性BALB/c小鼠，體重15～25 g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017—0001。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照、模型（DEN 50 mg·kg-1，ip給藥）、模型+SSb2 1.5，3.0和6.0 mg·kg-1（每日1次，ip給藥）和模型+DOX 1 mg·kg-1（隔日1次，ip給藥），每組10只。除正常對(duì)照組外，其余組小鼠ip給予DEN 50 mg·kg-1，每周2次；第5周開始DEN給藥減為每周1次，同時(shí)按分組給予SSb2和DOX，正常對(duì)照組在建模期間給予等體積生理鹽水，給藥持續(xù)19周。

1.3 樣本制備和計(jì)算肝指數(shù)

第19周末次給藥后24 h眼框取血，4℃，925×g離心10 min，取上清液分裝，用于后續(xù)血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。處死小鼠，取肝，稱重，計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝重（g）/體重（g）×100。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理改變

將肝組織在4%多聚甲醛溶液中固定12 h后石蠟包埋，制成4 μm切片，常規(guī)HE染色，在倒置顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.5 試劑盒檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)

取1.3制備的血清，按照試劑盒說明檢測(cè)小鼠血清中GOT，GTP，LDH和AFP的含量。

1.6 Western印跡法檢測(cè)肝組織中SlRT6和糖代謝通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取小鼠肝組織100 mg，置冰上間歇?jiǎng)驖{，裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)，14 800×g離心20 min。抽取上清，按BCA法測(cè)定蛋白含量。經(jīng)SDS-聚丙烯凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜（200 mA，120 min），5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，分別加入配好的一抗〔SIRT6、HIF1α、GLUT1、PDK1、LDHA和β肌動(dòng)蛋白（1∶1000）〕溶液，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌，用TBST稀釋的HRP標(biāo)記二抗（1∶50 000）浸泡PVDF膜，37℃搖床孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X光膠片壓片后顯影液發(fā)光顯色，晾干膠片。采用Gel-Pro analyzer 4.0分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值來表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS17.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型小鼠肝指數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，DEN誘導(dǎo)小鼠19周后，與正常對(duì)照組相比，模型組肝指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SSb2各劑量組與模型+DOX組小鼠肝指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of saikosaponin b2（SSb2）on liver index in the primary liver cancer model mice induced by diethyl nitrosamine（DEN）

2.2 SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，模型組肝細(xì)胞異形性明顯，可見多發(fā)癌巢組織，腫瘤細(xì)胞排列成假腺樣、腺管樣結(jié)構(gòu)（白色箭頭所示），提示模型建立成功。而模型+SSb2和模型+DOX組癌巢數(shù)量減少。模型+SSb2 1.5 mg·kg-1組癌巢周圍肝組織出現(xiàn)彌漫性水樣變性（藍(lán)色箭頭所示），肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；模型+SSb2 3.0 mg·kg-1組腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)嗜酸樣改變（綠色箭頭所示），灶狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型+SSb2 6 mg·kg-1組和模型+DOX組腫瘤細(xì)胞間可見大量淋巴細(xì)胞（紅色箭頭所示）和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（黃色箭頭所示），細(xì)胞出現(xiàn)片狀壞死。提示SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝癌有一定的抑制作用。

Fig.1 Effect of SSb2 on liver histopathology of primary liver cancer model mice induced by DEN（HE，200×）.See Tab.1 for the mouse treatment.White arrows indicate tumor cells arranged in pseudoglandular or glandular tubular structures；the blue arrow shows the diffuse watery degeneration of hepatic cells；the green arrow indicates the eosinophilic change in cytoplasm of tumor cell；the red arrow indicates a large number of lymphocytes next to the tumor cells；the yellow arrow indicates a large number of neutrophils in the liver tissue.

2.3 SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型小鼠血清GOT，GPT，LDH和AFP水平的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，模型組小鼠血清GOT，GPT，LDH和AFP水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SSb23.0和 6.0mg·kg-1組和模型+DOX組小鼠血清中GOT，GPT，LDH和AFP水平均顯著降低（P＜0.01），模型+SSb2 1.5 mg·kg-1組GOT，LDH和AFP水平均顯著降低（P＜0.01），提示SSb2對(duì)小鼠肝功能損傷具有抑制作用。

Tab.2 Effect of SSb2 on levels of serum glutamic oxaloacetic transaminase（GOT），glutamate pyruvic transaminase（GPT），lactate dehydrogenase（LDH）and alpha fetoprotein（AFP）in primary liver cancer model mice induced by DEN

2.4 SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌模型小鼠肝組織中糖代謝通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中SIRT6蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），HIF-1α，PDK1，GLUT1和LDHA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SSb2各劑量組和模型+DOX組SIRT6蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），模型+SSb2 3.0和6.0 mg·kg-1組及模型+DOX 組 HIF-1α，PDK1，GLUT1和LDHA蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），模型+SSb2 1.5 mg·kg-1組HIF-1α，PDK1和LDHA蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），提示SSb2可能是通過上調(diào)SIRT6蛋白表達(dá)，從而抑制下游HIF-1α以及糖代謝通路因子GLUT1，PDK1和LDHA蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制肝癌發(fā)生發(fā)展。

Fig.2 Effect of SSb2 on expressions of proteins related to glucose metabolism pathway in liver tissue of primary liver cancer model mice induced by DEN by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B1-B5 were the semi-quantitative results of A，respectively.SIRT6：silent information regulator 6；HIF-1α：hypoxia inducible factor 1α；GLUT1：glucose transporter 1；PDK1 ：pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1；LDHA：lactate dehydrogenase A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SSb2給藥后原發(fā)性肝癌小鼠肝指數(shù)降低，腫瘤細(xì)胞壞死增加，腫瘤生長(zhǎng)被抑制。此外，SSb2給藥組小鼠血清中GOT，GPT，LDH和AFP水平均降低，表明SSb2對(duì)DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌模型小鼠腫瘤的發(fā)展具有一定的抑制作用。

目前，關(guān)于SSb2在治療肝病方面藥理作用研究較少。Lin等[12]發(fā)現(xiàn)，SSb2可在早期有效抑制丙型肝炎病毒進(jìn)入體內(nèi)，包括中和病毒顆粒、防止病毒附著和抑制病毒進(jìn)入/融合。Shin等[13]發(fā)現(xiàn)，SSb2可能是炎癥相關(guān)疾病潛在治療藥物，它可通過干擾NF-κB抑制蛋白激酶β和NF-κB抑制蛋白活化，有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)釋放，從而阻止NF-κB活化。而本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSb2可以通過下調(diào)NF-κB蛋白的表達(dá)以及上調(diào)SIRT6蛋白的表達(dá)，從而對(duì)脂多糖/氨基半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷起到保護(hù)作用[14]。有研究表明，SIRT6在糖代謝過程中通過調(diào)控糖酵解影響線粒體呼吸[4]。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6還可作為抑癌因子，與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Marquardt等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織中SIRT6 mRNA和蛋白水平較正常癌旁組織明顯降低，過表達(dá)SIRT6能抑制肝癌細(xì)胞體外增殖和裸鼠腫瘤形成。Zhong等[17]發(fā)現(xiàn)，SIRT6作為組蛋白H3賴氨酸9的脫乙酰酶，可控制多種糖酵解基因表達(dá)，尤其是可以共抑制HIF-1α。在SIRT6基因沉默的胚胎干細(xì)胞中，HIF-1α合成和穩(wěn)定性增強(qiáng)，細(xì)胞葡萄糖攝取和糖酵解增強(qiáng)，有氧呼吸被抑制。這些表征與低氧條件下各種表征非常相似。此外，SIRT6敲除小鼠給予HIF-1α抑制劑后，小鼠血糖降低，提示SIRT6可能是通過HIF-1α發(fā)揮糖酵解調(diào)節(jié)作用。研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT6與HIF-1α靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)組蛋白H3賴氨酸9產(chǎn)生去乙酰基作用，直接抑制多種葡萄糖代謝蛋白，如PDK1，LDH，PFK1和GLUT1等表達(dá)[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌小鼠肝組織中SIRT6蛋白表達(dá)水平顯著降低，而HIF-1α，GLUT1，PDK1和LDHA表達(dá)顯著升高，說明原發(fā)性肝癌小鼠肝組織SIRT6蛋白表達(dá)下調(diào)，其對(duì)HIF-1α抑制作用減弱，HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)，下游糖酵解蛋白GLUT1，PDK1和LDHA的表達(dá)也隨之增強(qiáng)。而SSb2以及陽(yáng)性對(duì)照藥DOX作用后，小鼠肝組織的SIRT6表達(dá)升高，而HIF-1α表達(dá)降低，糖酵解蛋白GLUT1，PDK1和LDHA表達(dá)也降低，說明SSb2可能是通過上調(diào)SIRT6蛋白表達(dá)，從而抑制HIF1α調(diào)控的糖酵解通路，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制。但本研究尚未觀察SSb2是否直接通過SIRT6發(fā)揮調(diào)控作用，需深入研究。

綜上所述，SSb2可抑制DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌小鼠肝癌的發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制SIRT6介導(dǎo)的糖代謝通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。