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    鳳型大曲儲(chǔ)藏期不同部位理化指標(biāo)及微生物群落演替規(guī)律分析

    2023-01-14 07:41:16孟勤燕張永利閆宗科
    釀酒科技 2022年12期
    關(guān)鍵詞:大曲儲(chǔ)藏儲(chǔ)存

    張 艷,曹 丹,孟勤燕,張永利,閆宗科

    (陜西西鳳酒股份有限公司,陜西鳳翔 721406)

    近年來,各香型白酒對大曲培曲過程中理化指標(biāo)[1]、功能性酶活性[2]、風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生[3]及微生物菌群結(jié)構(gòu)[4-5]研究較多,但對大曲儲(chǔ)藏過程中各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)的變化規(guī)律研究甚少。有研究表明[6-8],大曲經(jīng)過一個(gè)月的培曲發(fā)酵,形成了多菌共存的微生物環(huán)境,使曲坯中含有大量生酸菌等雜菌,因而大曲培曲結(jié)束后必須經(jīng)過一段時(shí)間的儲(chǔ)存后熟期,待曲坯的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)及微生物菌群結(jié)構(gòu)經(jīng)過自然選擇趨于穩(wěn)定后投產(chǎn),避免因部分雜菌增殖造成酒醅生酸過猛,影響基酒質(zhì)量及產(chǎn)能;儲(chǔ)存期間部分有益微生物會(huì)繼續(xù)增殖進(jìn)而產(chǎn)生多種酶系,這些酶系在酒醅發(fā)酵時(shí)不僅有助于原料的利用,還能促進(jìn)白酒香氣的形成。研究表明大曲儲(chǔ)藏期對大曲質(zhì)量具有重要影響。為了從理論方面進(jìn)一步提高對鳳型大曲的認(rèn)識,構(gòu)建以微生物群落結(jié)構(gòu)為中心,輻射理化指標(biāo)的理論構(gòu)架,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,追蹤鳳型大曲儲(chǔ)藏階段理化指標(biāo)及微生物菌群環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,綜合分析鳳型大曲儲(chǔ)藏過程對白酒生產(chǎn)的重要價(jià)值,為后期功能微生物的篩選和鳳香型白酒生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供科學(xué)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑及儀器

    大曲樣品:選取鳳型大曲38#、64#兩房出房大曲進(jìn)行6個(gè)月的儲(chǔ)存期跟蹤。

    試劑:乙酸鈉、葡萄糖、斐林試劑、乙酸、可溶性淀粉等,均為分析純。

    儀器設(shè)備:冷凍高速離心機(jī)DH-2000R,上海德洋意邦儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱SPX-250-Ⅱ,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;恒溫水浴鍋SYG-2S,常州朗越儀器制造有限公司;電陶爐。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 取樣

    分別取儲(chǔ)藏1~6 個(gè)月的大曲樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定(儲(chǔ)存4 個(gè)月的大曲樣本因疫情影響未獲得)。曲塊外圍樣品粉碎作為曲皮樣,中心樣品粉碎作為曲心樣,完整大曲粉碎作為混合樣。

    1.2.2 理化指標(biāo)檢測

    理化指標(biāo)測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

    1.2.3 微生物群落多樣性檢測

    大曲樣品送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鳳型大曲儲(chǔ)存階段理化指標(biāo)變化規(guī)律研究

    2.1.1 水分變化規(guī)律

    水是微生物繁殖代謝必不可少的物質(zhì),在大曲儲(chǔ)藏期間參與到相關(guān)功能酶系及風(fēng)味物質(zhì)的合成過程[9]。從圖1 可以看出,曲皮水分流失較快,整個(gè)儲(chǔ)藏過程中始終低于曲心,整體變化規(guī)律基本一致。與儲(chǔ)藏前相比,儲(chǔ)藏過程中部分水分流失或被微生物利用,六個(gè)月后水分含量略有降低?;旌蠘铀痔幱谇ず颓闹g,變化規(guī)律與曲皮曲心基本相似。

    圖1 大曲儲(chǔ)存期水分含量變化

    2.1.2 淀粉含量變化規(guī)律

    淀粉是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì),淀粉含量的變化可反映微生物對淀粉的利用情況,與大曲發(fā)酵儲(chǔ)藏過程中糖化酶和液化酶活性關(guān)系密切[10]。由圖2可知,儲(chǔ)藏期間由于微生物的分解利用,大曲中淀粉含量隨儲(chǔ)藏期的延長整體呈下降趨勢。儲(chǔ)存前期大曲曲皮曲心微生物生長消耗淀粉,淀粉含量逐漸降低;后期曲心微生物受水分、氧氣等影響,生長緩慢,淀粉利用率降低,含量穩(wěn)定,曲皮微生物仍可消耗淀粉進(jìn)行生長繁殖。

    圖2 大曲儲(chǔ)存期淀粉含量變化

    2.1.3 酸度變化規(guī)律

    酸度是評價(jià)大曲質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。如圖3所示,儲(chǔ)藏前期大曲酸度有所降低,儲(chǔ)藏至三個(gè)月時(shí)由于產(chǎn)酸微生物(主要是乳酸菌和醋酸菌)等代謝產(chǎn)生有機(jī)酸使大曲的酸度升高,后期由于水分、能量物質(zhì)等的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累,微生物生長受到抑制,部分有機(jī)酸被微生物利用以及參與到香味物質(zhì)等的合成中,大曲酸度逐漸降低后趨于穩(wěn)定。整體來看,大曲曲皮酸度高于曲心,主要與曲皮微生物相對豐度較高,繁殖較快有關(guān)。

    圖3 大曲儲(chǔ)存期酸度變化

    2.1.4 糖化力變化規(guī)律

    如圖4 所示,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長,受曲皮表面水分流失、溫度變化等的影響,曲皮糖化力有所降低,儲(chǔ)存至3 個(gè)月時(shí),曲皮中霉菌繁殖使糖化酶活力增強(qiáng),大曲糖化力明顯升高,后期由于水分流失,營養(yǎng)物質(zhì)消耗以及代謝產(chǎn)物的積累[11],微生物生長緩慢,使曲皮糖化力逐漸降低后趨于穩(wěn)定。曲心水分、溫度等受環(huán)境影響較小,糖化力變化較小,儲(chǔ)存3 個(gè)月時(shí)曲心內(nèi)部霉菌增殖使糖化力略有升高,后期逐漸趨于穩(wěn)定。整個(gè)儲(chǔ)藏過程中,曲皮糖化力始終高于曲心。混合樣大曲的糖化力變化規(guī)律與曲皮相似,表征曲坯在儲(chǔ)存期間糖化力的基本變化情況。

    圖4 大曲儲(chǔ)存期糖化力變化

    2.1.5 發(fā)酵力變化規(guī)律

    大曲發(fā)酵力與酵母菌關(guān)系密切,發(fā)酵力高低直接關(guān)系到出酒率的高低[12]。由圖5可知,儲(chǔ)藏初期,大曲發(fā)酵力處于較低水平,隨著曲坯中酵母菌等微生物的增殖,曲皮曲心發(fā)酵力有不同程度提高;儲(chǔ)藏2 個(gè)月后,由于水分、氧氣以及環(huán)境等的變化,微生物生長受到抑制,曲皮曲心發(fā)酵力有所降低;后期微生物菌群動(dòng)態(tài)變化使得大曲發(fā)酵力又有所升高。整個(gè)儲(chǔ)藏過程中,曲皮發(fā)酵力始終高于曲心,結(jié)合微生物多樣性分析,可能與鳳型大曲曲皮中乳酸菌相對豐度高于曲心有關(guān)。大曲混合樣的發(fā)酵力始終處于曲皮和曲心之間,變化趨勢同曲心基本相似。

    圖5 大曲儲(chǔ)存期發(fā)酵力變化

    2.1.6 酯化力變化規(guī)律

    大曲酯化力高低受細(xì)菌影響較大,關(guān)系到大曲風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。從圖6 可以看出,整個(gè)儲(chǔ)藏過程中曲皮曲心的酯化力變化基本一致,曲心酯化力始終高于曲皮,混合樣酯化力介于曲心和曲皮之間。儲(chǔ)藏前期兩房大曲酯化力都較低,隨著儲(chǔ)藏期的延長,大曲中微生物繁殖產(chǎn)生大量酶系,酯化力逐漸增強(qiáng),儲(chǔ)存至3 個(gè)月時(shí)酯化力達(dá)到較高水平,在隨后的儲(chǔ)藏過程中,受環(huán)境及大曲自身溫度、水分條件的影響,大曲酯化力逐漸降低后趨于穩(wěn)定直至儲(chǔ)存期結(jié)束。這與李潔等[14]的研究結(jié)果相吻合。

    2.2 鳳型大曲儲(chǔ)存階段微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

    2.2.1 真菌微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

    2.2.1.1 物種分類學(xué)分析

    由圖7 可知,大曲儲(chǔ)存階段曲坯中真菌群落歸屬于4 個(gè)菌門,分別為子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycita)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)。儲(chǔ)存期大曲曲皮中Ascomycota 占絕對優(yōu)勢,相對豐度在85 %以上,Mucoromycita 占比在9.68%以上,Basidiomycota、Mortierellomycota 占比極??;曲心中Ascomycota 占比達(dá)99.9%以上;混合樣中Ascomycota 占比在98 %以上,含有少量的Mucoromycita,占比在1%左右。

    圖7 儲(chǔ)存期大曲門水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布

    大曲中微生物種類繁多,不同菌群間相互作用不僅促進(jìn)了大曲的成熟,而且產(chǎn)生眾多酶系為白酒發(fā)酵提供動(dòng)力[15]。從圖8 可以看出,儲(chǔ)藏期曲坯中真菌屬種類較少,曲皮曲心種群豐富度差異較大,但均以Thermoascus(嗜熱子囊菌)為主,大曲在發(fā)酵過程中經(jīng)過大火期,高溫條件使大部分微生物死亡,耐高溫的Thermoascus得以存活。大曲儲(chǔ)藏1個(gè)月時(shí)曲皮中優(yōu)勢菌群除Thermoascus外,還有一定量的Aspergillus(曲霉菌屬)、Pichia(畢赤酵母屬)以及Rhizopus(根霉菌屬),后隨著儲(chǔ)存期的延長,曲皮中優(yōu)勢菌群Thermoascus占比略有降低,直至儲(chǔ)存六個(gè)月時(shí)又有所升高;Aspergillus相對豐度在儲(chǔ)存兩個(gè)月時(shí)迅速降低直至儲(chǔ)藏期結(jié)束,占比均在1 %以下;Pichia和Rhizopus占比在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中變化不大。由于曲心內(nèi)部受水分、溫度變化影響較小,微生物數(shù)量變化不明顯,曲心菌群中Thermoascus和Aspergillus占絕對優(yōu)勢,整個(gè)儲(chǔ)存過程中相對豐度達(dá)99 % 以上;混合樣中Thermoascus始終占主導(dǎo)地位,儲(chǔ)存期相對豐度在46.96 %~60.90%之間,呈先增大后降低的趨勢,在儲(chǔ)存的第三個(gè)月相對豐度最大,Aspergillus和Pichia也占有一定比例,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長,Aspergillus與Thermoascus相對豐度呈現(xiàn)此消彼長的變化趨勢,Pichia在整個(gè)發(fā)酵期相對豐度為8.11 %~14.34 %。大曲中優(yōu)勢微生物對白酒釀造至關(guān)重要,不同大曲中優(yōu)勢菌屬不同形成了不同香型的白酒[16-17]。

    圖8 儲(chǔ)存期大曲屬水平top10真菌組成柱狀圖

    2.2.1.2 Alpha多樣性分析通過Illumina高通量測序?qū)P型大曲儲(chǔ)存階段曲坯不同部位真菌群落進(jìn)行多樣性分析,在97 %相似度水平下對序列聚類并進(jìn)行OTU 劃分,結(jié)果見表1。

    表1 大曲儲(chǔ)存階段不同部位真菌Alpha 多樣性指數(shù)

    Alpha 多樣性是對單個(gè)樣本內(nèi)微生物群落進(jìn)行多樣性和豐富度分析。表1 中coverage 數(shù)值在0.999957~0.999994 之間,表明本次測序結(jié)果能完整反映儲(chǔ)存期大曲中真菌菌群組成的真實(shí)情況。由表1 可知,大曲儲(chǔ)存階段曲皮、曲心及混合樣品中真菌群落豐富度隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律,多樣性受儲(chǔ)存時(shí)間影響較小。整體來看曲皮中真菌群落多樣性和豐富度明顯高于曲心,混合樣品居于曲皮和曲心之間,接近曲皮。大曲儲(chǔ)存期是曲坯后熟階段,出房新曲中含有的真菌在儲(chǔ)存階段經(jīng)過自然生長消亡逐漸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài),大曲的生化性能等也逐漸趨于穩(wěn)定,為后期酒醅發(fā)酵提供動(dòng)力基礎(chǔ)[18]。

    2.2.1.3 層次聚類分析

    圖9 是儲(chǔ)存期大曲真菌群落層次聚類樹及對應(yīng)的屬水平top10 物種豐度,根據(jù)0.2 聚類距離劃分,圖中所有樣本被分為三大類,儲(chǔ)存2 個(gè)月、3 個(gè)月、5 個(gè)月、6 個(gè)月的曲皮樣本被分為一類,曲心樣本被分為一類,混合樣本、儲(chǔ)存一個(gè)月的曲皮樣本被分為一類,三大類下又被分為不同小類。整體而言,除QC1P 樣本外,曲皮、曲心、混合樣本分別被劃分為不同類,說明儲(chǔ)存期大曲曲皮、曲心、混合樣中真菌群落組成及相對豐度存在明顯差異。對比物種豐度圖來看,混合樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus、Pichia、Rhizopus,曲心樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus,曲皮樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Pichia、Rhizopus,不同類別下真菌菌群物種組成及相對豐度各不相同。

    圖9 儲(chǔ)存期大曲樣本中真菌聚類樹圖

    2.2.2 細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

    2.2.2.1 物種分類學(xué)分析

    鳳型大曲儲(chǔ)存階段門水平下共檢出25 種細(xì)菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等。由圖10可知,儲(chǔ)存期大曲曲皮、曲心、混合樣品中Firmicutes 為優(yōu)勢菌門,但相對豐度有所差異,曲皮占比56.83%~76.64%,曲心占比15.73%~30.13%,混合樣占比63.89 %~71.99 %;Actinobacteria 和Proteobacteria 也占有一定比例,二者在曲皮和混合樣中的相對豐度明顯高于曲心,這主要是因?yàn)榇笄嗲笃谇きh(huán)境利于細(xì)菌生長,故相對豐度較高,曲心因高溫缺氧抑制了細(xì)菌的生長,相對豐度較低。

    圖10 儲(chǔ)存期大曲門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

    圖11 儲(chǔ)存期大曲屬水平top10細(xì)菌組成柱狀圖

    大曲儲(chǔ)存期間細(xì)菌物種組成豐富,曲皮曲心細(xì)菌種類及占比差異較大。在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中,曲皮細(xì)菌主要以Lactobacillus(乳桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)為主,Lactobacillus在儲(chǔ)藏3 個(gè)月時(shí)相對豐度增大至39.27 %,后期又降低至30 %左右,Weissella占比在20.88 %~26.48%;儲(chǔ)藏前期曲皮中Staphylococcus(葡萄球菌屬)占比極小,只有0.29 %,在儲(chǔ)藏的第2 個(gè)月,對環(huán)境有所適應(yīng)的微生物再次生長繁殖,Staphylococcus占比迅速增大至3.85%,直至儲(chǔ)藏期結(jié)束相對豐度變化不大;Streptomyces在儲(chǔ)藏的前期和后期相對豐度占比較大,但儲(chǔ)藏2~3 個(gè)月時(shí)由于Lactobacillus、Acetobacter(醋桿菌屬)等細(xì)菌的增殖,Streptomyces占比有所降低;曲皮中Brevibacterium(短桿菌屬)和Corynebacterium(棒狀桿菌屬)在儲(chǔ)藏中期相對豐度明顯增大,后期隨著曲皮水分流失及微生物衰亡,相對豐度降低。曲心細(xì)菌主要以Lactobacillus和Weissella為主,隨著儲(chǔ)藏期延長,二者相對豐度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,這可能是大曲培曲階段曲心內(nèi)部細(xì)菌受條件限制繁殖情況較曲皮弱,營養(yǎng)物質(zhì)消耗少,儲(chǔ)存階段曲心細(xì)菌會(huì)小幅度增殖,至儲(chǔ)存6 個(gè)月時(shí)隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗、產(chǎn)物積累等生長環(huán)境變化抑制了其進(jìn)一步生長繁殖,相對豐度降低;儲(chǔ)藏前期Staphylococcus占比達(dá)到48 %,但從第2 個(gè)月開始占比迅速降低至2 %,直至儲(chǔ)藏期結(jié)束占比一直較低,這可能是因?yàn)镾taphylococcus生長對氧氣、水分等的需求較大,其他微生物的生長對氧氣等的消耗抑制了它的生長。儲(chǔ)存5 個(gè)月的混合樣中Staphylococcus和Corynebacterium占比較大,區(qū)別于其他月份?;旌蠘又屑?xì)菌主要以Lactobacillus、Weissella和Streptomyces為主,占比60.54%~72.48%。大曲儲(chǔ)藏過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在自然環(huán)境下不斷調(diào)整,形成最佳的微生態(tài)環(huán)境,為后期釀造發(fā)酵提供動(dòng)力基礎(chǔ)[19]。

    2.2.2.2 Alpha多樣性分析

    通過Illumina高通量測序?qū)?chǔ)存期大曲樣本進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析,在97 %相似度水平下對序列聚類并進(jìn)行OTU劃分,結(jié)果見表2。

    表2 儲(chǔ)存大曲細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

    對儲(chǔ)存期大曲中不同部位的細(xì)菌菌群進(jìn)行Alpha 多樣性分析,結(jié)果見表2。表中coverage 數(shù)值在0.97958~0.99478 之間,表明本次測序結(jié)果能完整反映儲(chǔ)存期大曲中細(xì)菌菌群組成的真實(shí)情況。Chao1 和Observed_species 指數(shù)反映了大曲中細(xì)菌的豐富度,從表2 可以看出,儲(chǔ)存期大曲曲皮中細(xì)菌豐富度高于曲心和混合樣,且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長,曲皮、曲心、混合樣中細(xì)菌豐富度均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,這與儲(chǔ)存期大曲中真菌豐富度的變化規(guī)律相同,表明大曲儲(chǔ)存期間仍有部分真菌和細(xì)菌繼續(xù)增殖,通過自身不斷的代謝調(diào)整逐漸形成穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)[20]。儲(chǔ)存一個(gè)月的曲皮曲心中細(xì)菌多樣性較低,第2 個(gè)月開始隨著微生物增殖,細(xì)菌多樣性有所增大。

    2.2.2.3 層次聚類分析

    對儲(chǔ)存期大曲中細(xì)菌群落基于Weighted Unifrac 距離算法進(jìn)行層次聚類分析,可直觀反映各樣本之間的相似性。根據(jù)0.25 聚類距離劃分,圖12中所有樣本被分為兩大類,每一類下又被分為多個(gè)小類,同一分支的樣本表明其相似性高。整體來看,曲心樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和曲皮樣本差異較大,混合樣本的相似性和曲皮較為相似,對應(yīng)屬水平top10 物種豐度圖可知,這種差異主要源于大曲不同部位細(xì)菌組成的多樣性和豐富度。

    圖12 儲(chǔ)存期大曲樣本中細(xì)菌聚類樹圖

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)對鳳型大曲儲(chǔ)存后熟期的理化指標(biāo)和微生物菌群演替規(guī)律進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:鳳型大曲儲(chǔ)藏期微生物會(huì)小范圍增殖,大曲水分下降5%左右,曲心始終高于曲皮;微生物對淀粉的利用率在2%~7%之間;儲(chǔ)存期大曲中酸、醇等物質(zhì)相互作用,使曲坯酸度在儲(chǔ)存結(jié)束后有所降低;儲(chǔ)存期大曲糖化力、發(fā)酵力曲皮高于曲心,酯化力曲心較曲皮高,儲(chǔ)藏2~3 個(gè)月時(shí)隨著微生物的變化,糖化力、發(fā)酵力、酯化力較高,后期逐漸趨于穩(wěn)定。儲(chǔ)存期大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)組成不同,曲皮以Thermoascus、Pichia、Rhizopus為主,相對豐度占比52 %~84 %,曲心以Thermoascus、Aspergillus為主,占比99 %以上。對比培曲階段曲坯真菌群落結(jié)構(gòu)來看[21],儲(chǔ)存階段曲皮真菌結(jié)構(gòu)組成變化較大,由出房曲的以Thermoascus、Issatchenkia為主演變?yōu)橐訲hermoascus、Pichia、Rhizopus為主,曲心微生物優(yōu)勢菌屬始終為Thermoascus和Aspergillus。儲(chǔ)存期大曲中曲皮曲心細(xì)菌組成種類相似,均以Lactobacillus、Weissella、Streptomyces為主,但相對豐度占比差異較大,曲皮在77%~88%之間,曲心在20 %~55 %之間。Alpha 多樣性結(jié)果進(jìn)一步表明儲(chǔ)存期大曲曲皮微生物多樣性較曲心高。聚類分析結(jié)果表明鳳型大曲曲皮、曲心中微生物多樣性和豐富度存在明顯差異。

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