主成分結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化酒牛膝飲片均勻化工藝

胡婷婷，李金洋，翟俊杰，劉文蘋，盧寶偉，孟祥松

（1.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽亳州 236800；2.皖西學(xué)院，安徽六安 237012）

牛膝作為我國一種常用大宗藥材商品，來源為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentataBl.）的干燥根，主要產(chǎn)自河南，是著名的“四大懷藥”之一。牛膝藥性苦、甘、酸，平。歸肝、腎經(jīng)。具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無力、淋證、水腫、頭痛、眩暈、牙痛、口瘡、吐血、衄血[1]。現(xiàn)代研究表明，牛膝在抗腫瘤[2]、抗炎鎮(zhèn)痛[3]、抗骨質(zhì)疏松[4]、降血糖[5]、保肝[6]和增強(qiáng)免疫[7]等方面均具有顯著的藥理作用。牛膝酒炙之后可增強(qiáng)活血通絡(luò)的作用，用于經(jīng)閉癥瘕、腰膝酸痛、筋骨無力等。

由于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在表征質(zhì)量信息時(shí)具有一定的局限性，所以常用的化學(xué)對照品、對照藥材及對照提取物均無法完全反映出中藥飲片的科學(xué)內(nèi)涵與特征屬性，而中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片的出現(xiàn)恰好填補(bǔ)了現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺口[8]。利用中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)對飲片藥效物質(zhì)群的整體控制，以此制定的飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)才更具有科學(xué)性和實(shí)用性[9]。中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻性是保證其質(zhì)量的重要條件之一，目前尚未見關(guān)于酒牛膝飲片均勻化研究的報(bào)道，而筆者在研究前期對市場上現(xiàn)有的牛膝對照藥材粉末進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的結(jié)塊、泛糖等現(xiàn)象。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期調(diào)研基礎(chǔ)參考牛膝對照藥材的粉碎方式，以牛膝出粉率、β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮為指標(biāo)，應(yīng)用主成分分析求得總因子得分（F），以F為綜合指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對牛膝飲片均勻化工藝中的投料量、打粉次數(shù)、每次打粉時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，篩選其最佳均勻化工藝，以期為酒牛膝飲片均勻化技術(shù)規(guī)范的制定提供全面的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

藥典2～6 號(hào)篩（浙江上虞市五四儀器篩具廠）;FW-200 型高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);GX-800 型鼓泡清洗機(jī)（杭州海善制藥設(shè)備有限公司）;高效液相色譜儀（waters waters 2487UV 檢測器）;QRZG-300型直線往復(fù)式切藥機(jī)（杭州海善制藥設(shè)備有限公司）；CG-600Z 型自控溫鼓式炒藥機(jī)（杭州海善制藥設(shè)備有限公司）；十萬分之一電子分析天平（BT25S賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

牛膝樣品購于河南省武陟縣大豐鄉(xiāng)架部四村，為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentataBl.）的干燥根；25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為210414,210720）；β-蛻皮甾酮（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS-21062801）；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 樣品制備

2.1 酒牛膝飲片的制備

取牛膝藥材，放置于挑選工作臺(tái)上。揀去藥材中的雜質(zhì)、異物、非藥用部分后裝入潔凈容器內(nèi)，用水沖洗，至無泥沙，用濕紗布覆蓋，放置3 h，將牛膝切成規(guī)格為3～4 mm 厚片，攤放在溫度為60 ℃的烘箱中烘干，干燥時(shí)間為4.5 h。加入0.1 倍的黃酒，拌勻，悶1 h 至黃酒被吸盡。將拌勻悶透后的牛膝置預(yù)熱好的熱鍋中，溫度為90～110 ℃炒15 min 至干，有酒香氣，取出，晾涼備用。

3 方法與結(jié)果

3.1 粉碎粒徑考察

取酒牛膝飲片適量，采用打粉機(jī)粉碎，粉末采用10、24、50、65、80、100 目篩處理，分為未過10、10～24、24～50、50～65、65～80、80～100、100～200 目篩7 組(編號(hào)J0、J1、J2、J3、J4、J5、J6)，參照前期實(shí)驗(yàn)成果[10]中甾酮類成分含量測定方法進(jìn)行測定具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，不同粒度色譜疊加圖見圖1。

圖1 酒牛膝不同粒徑粉末疊加色譜圖

表1 酒牛膝樣品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮含量測定結(jié)果

分別以酒牛膝不同粒度粉末為橫坐標(biāo)，以上述實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果中的β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮的含量為縱坐標(biāo)繪制折線圖，見圖2。

圖2 酒牛膝不同粒度下有效成分含量折線圖

酒牛膝粉末的三種甾酮類含量隨著粒徑變小，呈現(xiàn)上升趨勢，隨著粉碎粒度的增加最后呈現(xiàn)下降趨勢，并且表現(xiàn)在過50～65 目(3 號(hào)篩)下含量最高，在預(yù)試驗(yàn)時(shí)將粉末粉碎至200 目耗時(shí)長，且大于200目的收率較小，因此考慮將其均勻化的粉碎工藝粉末粒度定為過3號(hào)篩。

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 投料量的選擇

分別稱取酒牛膝飲片20、30、40、50、60、70、80 g，采用FW-200型高速多功能粉碎機(jī)，在26 000 r/min轉(zhuǎn)速下，粉碎1次，粉碎時(shí)間均為30 s，過3號(hào)篩，稱通過3號(hào)篩藥粉重量，記為出粉量，計(jì)算出粉率。結(jié)果見表2。

表2 投料量對出粉率的影響

3.2.2 打粉次數(shù)的選擇

稱取酒牛膝飲片60 g，采用FW-200 型高速多功能粉碎機(jī)，在26 000 r/min 轉(zhuǎn)速下，每次粉碎時(shí)間為10 s，粉碎多次，直至不能粉碎為止，過3 號(hào)篩，稱藥粉重量，記累計(jì)出粉量，累計(jì)出粉率和每次出粉率見表3。

表3 打粉次數(shù)對出粉率的影響

3.2.3 每次打粉時(shí)間的選擇

稱取牛膝飲片60 g，采用FW-200 型高速多功能粉碎機(jī)，在26 000 r/min 轉(zhuǎn)速下，打粉3 次，每次粉碎時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 s，計(jì)算總出粉率和每次出粉率，結(jié)果見表4。

表4 每次打粉時(shí)間對出粉率的影響

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以投料量(A)、打粉次數(shù)(B)、每次打粉時(shí)間(C)為自變量，以F值為響應(yīng)值，其因素水平編碼見表5。

表5 試驗(yàn)因素水平編碼表

3.4 牛膝甾酮類有效成分含量的測定

結(jié)合前期研究成果參照文獻(xiàn)[10]對17 組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酒牛膝中牛膝甾酮類有效成分含量測定，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 PCA分析

（1）主成分提取及其貢獻(xiàn)率的計(jì)算：將上述表中響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果輸入SPSS 22.0 軟件，進(jìn)行PCA，總方差的解釋見表7，主成分系數(shù)矩陣見表8。

表7 解釋的總方差

表8 成份矩陣

軟件默認(rèn)特征值大于1 的成分作為主成分，由表6 知，第1 個(gè)成分（出粉率）的初始特征值大于1，但其對總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)率只有76.084%，偏小，若提取前2 個(gè)成分（出粉率和β-蛻皮甾酮），累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到99.689%，可以保留原始變量的大部分信息，因此選取前2 個(gè)成分作為分析所用的主成分。

（2）F值的計(jì)算：以主成分因子得分與其方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，可以得出各試驗(yàn)組的F，F(xiàn)的計(jì)算公式為F=F1×0.76084+F2×0.23605，其中主成分的表達(dá)式可以由表8 中的成分矩陣推出，前2 個(gè)主成分的表達(dá)式分別為：F1=-0.1645×Z1+0.5694×Z2+0.5702×Z3+0.5689×Z4，F(xiàn)2=0.9859×Z1+0.0923×Z2+0.0727×Z3+0.1200×Z4.

按照以上公式計(jì)算響應(yīng)面法試驗(yàn)各組的F值，F(xiàn)值的結(jié)果見表9。

表9 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及F值結(jié)果

使用Design-Expert8.06軟件進(jìn)行回歸模型分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果得出投料量、打粉次數(shù)、每次打粉時(shí)間與F值的多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為：Y=-5.90513+0.12543A+4.0014B+0.4719C-1.375×10-3AB-2.5×10-5AC-0.0555BC-1.09625 × 10-3A2-0.34338B2-5.835×10-3C2,方差分析及系統(tǒng)顯著性檢驗(yàn)見表10。

表10 響應(yīng)面方差分析

由表10 可知模型的P=0.0003,說明該回歸模型顯著，用該模型分析各因素對F值的影響具有意義?；貧w系數(shù)模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出：模型中一次項(xiàng)中B（打粉次數(shù)）C（每次打粉時(shí)間）具有顯著性，交互作用BC顯著，二次項(xiàng)中B2、C2具有顯著性，按照對結(jié)果的影響大小排序?yàn)椋捍蚍鄞螖?shù)＞每次打粉時(shí)間＞投料量，通過求解回歸方程，得出酒牛膝飲片最佳均勻化條件為投料量為60 g，打粉次數(shù)為3 次，每次打粉時(shí)間為20 s，各因素相互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖見圖3。

圖3 各因素相互作用等高線圖和響應(yīng)曲面圖

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述優(yōu)化的最佳均勻化工藝條件下進(jìn)行3 次試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值與理論預(yù)測值相對誤差小于5%，說明該方程與實(shí)際結(jié)果擬合良好。

4 討論

針對酒牛膝對照藥材粉末容易“泛糖”等目前常見的問題，對其進(jìn)行研究。粉碎時(shí)間考察范圍為5～30 s 時(shí)，總出粉率和總出粉量會(huì)隨著粉碎時(shí)間不斷地增加也不斷地增大。每次粉碎時(shí)間為10 s 時(shí)，投藥量為60 g，隨著打粉次數(shù)的不斷增加，總出粉量和總出粉率不斷增加，但各出粉率增加值均呈緩慢下降趨勢。投料量考察范圍在20～ 60 g 時(shí)，總出粉率會(huì)隨著投料量的增加而增加，而當(dāng)投料量達(dá)到60 g 以上的時(shí)候，出粉率反而降低。采用主成分分析及響應(yīng)面法進(jìn)行篩選，優(yōu)選出酒牛膝均勻化飲片的最佳工藝為投料量60 g，打粉3次，每次打粉時(shí)間20 s。該方法最大程度地避免酒牛膝粉末成塊泛糖等現(xiàn)象，為酒牛膝飲片及其他類似飲片的質(zhì)量控制提供了一種新的更加專屬、科學(xué)、客觀的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)參考。

酒牛膝飲片均勻化工藝的應(yīng)用既避免了化學(xué)對照品分離難度大、供不應(yīng)求等問題，又能夠較牛膝對照藥材反應(yīng)更全面、更準(zhǔn)確的飲片內(nèi)在屬性信息，與中醫(yī)特色相吻合，是適合飲片質(zhì)量評價(jià)的最佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

牛膝為臨床上常用的飲片，而通過酒炙之后其補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨功效會(huì)增強(qiáng)，因此，酒牛膝飲片的質(zhì)量控制需要更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。目前，市場上很多對于酒牛膝飲片對照物如對照藥材都是在原藥材的基礎(chǔ)上進(jìn)行粉碎，忽略了炮制對于飲片的影響，飲片中成分的復(fù)雜、復(fù)方中不同中藥成分之間的相互作用，導(dǎo)致很難在短時(shí)間內(nèi)研究清楚牛膝飲片的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，而酒牛膝均勻化工藝能夠避免這一困難，從宏觀上控制酒牛膝飲片的質(zhì)量。