12種中草藥活性成分治療肺結(jié)核潛在機(jī)制研究

任明輝，央 拉，楊 娟，任建偉，杜寶中

（西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西藏拉薩 850000）

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染的一種慢性傳染病。2020 年WHO 發(fā)布全球新發(fā)結(jié)核病患者約987萬[1]，在30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中我國估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)排第2 位，2020 年我國新發(fā)結(jié)核病患者約84.2萬，發(fā)病率為59/10 萬，其中6.5 萬為多重耐藥性肺結(jié)核?，F(xiàn)有的抗結(jié)核藥物數(shù)量和高效性有限，新藥物的研發(fā)面臨許多障礙，而耐藥性肺結(jié)核、多重耐藥性肺結(jié)核病的出現(xiàn)，使得肺結(jié)核的臨床治療面臨著藥物缺乏的現(xiàn)狀，因此尋找高效、低毒且具有抗耐藥性治療藥物迫在眉睫。

越來越多的研究闡明，中草藥具有良好的抗菌作用、不良反應(yīng)相對較小且不易出現(xiàn)耐藥性等特點[2-5]。近年來中草藥體外抗結(jié)核分枝桿菌有了很大進(jìn)展，但中草藥活性成分治療肺結(jié)核病研究較少。本研究從體外抗結(jié)核分枝桿菌效果較好的中草藥活性成分探究其治療肺結(jié)核病的潛在機(jī)制，為臨床上中草藥活性成分治療肺結(jié)核病提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 體外抗結(jié)核分枝桿菌活性效果較好的中草藥活性成分獲取

利用PubMed、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，輸入“中草藥”和“結(jié)核分枝桿菌”，以體外抗結(jié)核分枝桿菌MIC值≤200 mg/L為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢索，后通過Zinc數(shù)據(jù)庫下載，通過StoneMIND Collector 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)識別并對中草藥活性成分進(jìn)行修飾和下載其sdf格式。

1.2 肺結(jié)核病的核心靶點基因及相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)獲取

利用GeneGards 數(shù)據(jù)庫，以“Pulmonary Tuberculosis”為檢索名稱，限定“score≥30”篩選出肺結(jié)核病的核心靶點基因。蛋白分子下載通過PDB 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)分子對接蛋白結(jié)構(gòu)六大原則[6]進(jìn)行篩選，最終獲取可靠性最高的蛋白結(jié)構(gòu)并下載PDB Format格式。

1.3 分子對接預(yù)測活性成分與肺結(jié)核病的核心靶點基因結(jié)合活性

利用Discovery Studio Client 2019 軟件將檢索出的中草藥活性成分和肺結(jié)核病的核心靶點基因進(jìn)行分子對接預(yù)測其結(jié)合活性。

1.4 生物通絡(luò)富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，設(shè)置“Homo sapiens”分析條件后，對肺結(jié)核病的核心靶點基因進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.01，并對結(jié)果作桑基圖、條形圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 體外抗結(jié)核分枝桿菌活性較好的中草藥活性成分獲取結(jié)果

經(jīng)過檢索和篩選共獲取12 種在體外抗結(jié)核分枝桿菌具有較好活性的中草藥活性成分，分別是姜黃素、白黎醇素、蟲草素、槲皮素、大蒜素、異甘草素、穿心蓮內(nèi)酯、沒食子酸、黃連素、黃芩苷、紅景天苷、巖白菜素。

2.2 肺結(jié)核病的核心靶點基因及相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)獲取結(jié)果

利用GeneGards 數(shù)據(jù)庫，以“Pulmonary Tuberculosis”為檢索名稱，共檢索出1985 個靶點基因，根據(jù)“score≥30”篩選出20 個核心靶點基因。蛋白結(jié)構(gòu)下載通過PDB 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)分子對接蛋白結(jié)構(gòu)六大原則，共計獲取14個核心靶點基因相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)，其相應(yīng)核心靶點基因為CAV1、CRP、HLA-DRB1、IFNG、IL6、IL10、MMP1、SERP、SFTPC、SFTBD、TGFB1、TLR2、TNF、TERT。

2.3 分子對接預(yù)測結(jié)合活性結(jié)果

利用ZinC 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索12 種中草藥活性分子3D 分子結(jié)構(gòu)式，并通過StoneMIND Collector 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)識別和修飾，利用Discovery Studio Client 2019 對中草藥活性成分和蛋白進(jìn)行修飾后完成對接。根據(jù)分子對接結(jié)果評分，對接效果越好即評分越高圖示顏色越紅，無法對接即對接失敗對接評分為0分并用深藍(lán)色表示，如圖1。

圖1 12種中草藥活性分子與肺結(jié)核病的核心靶點基因?qū)訜峋蹐D

2.4 生物通絡(luò)富集分析結(jié)果

將肺結(jié)核病的核心靶點基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.01，共計獲得136條GO功能條目和49條KEGG 通路，對與治療肺結(jié)核病相關(guān)性較高的KEGG 信號通路和GO功能進(jìn)行可視化分析，見圖2、圖3。

圖2 KEGG通路分析桑基圖

圖3 GO功能分析條形圖

3 討論

肺結(jié)核是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。由于耐藥性和多重耐藥性肺結(jié)核的增加，現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物數(shù)量和高效性有限，新藥物的研發(fā)面臨許多障礙，迫切需要找到新的解決方案。

從篩選出的肺結(jié)核病核心靶點基因上看，CAV1可激活和調(diào)節(jié)先天免疫、炎癥、血管通透性和白細(xì)胞遷移，與toll 樣受體4(TLR4)結(jié)合，然后介導(dǎo)NF-κB激活并觸發(fā)炎癥反應(yīng)[7-8]。CRP 是一種宿主防疫蛋白，CRP 復(fù)合物對補(bǔ)體激活和調(diào)節(jié)是有益的[9]。IFNG和IFNGR1的單核苷酸多態(tài)性可能參與不同人群肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制，IFNG/IFNGR1 途徑在人類對結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)中具有一定潛在作用[9]。IL-6已被鑒定為一種26 kD 的分泌蛋白，可作為疾病治療的靶點[10]，Gp130 是IL-6 細(xì)胞因子家族共有的受體成分，在脾、肺、心臟和肝臟等多個器官中普遍表達(dá)，IL-6 家族細(xì)胞因子可通過Gp130 同源二聚體或含Gp130 的異源二聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號達(dá)到治療肺部炎癥的目的[11]。IL-10是一種具有抗炎特性的細(xì)胞因子，是維持有效免疫和組織保護(hù)之間微妙平衡的核心[12]。通過限制對病原體免疫反應(yīng)從而防止對宿主的損害在感染中起核心作用[13]。MMP1 是呼吸道表面基質(zhì)金屬蛋白酶對肺損傷后完整上皮的恢復(fù)以及肺穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)至關(guān)重要[14]。在機(jī)體缺氧時HIF-1α 積累導(dǎo)致促炎因子表達(dá)，但MMP1 在缺氧狀態(tài)下表達(dá)量超正常情況下170倍并具有活性，對肺組織保護(hù)性增強(qiáng)[15]。SERP 可有效減輕炎癥、減少纖維化和新生血管形成，而不影響其他器官[16]。SERP 可能是繞過高爾基體的主要分泌機(jī)制，并且在神經(jīng)突生長中特別活躍和重要[17]。SFTPC、SFTPD 為肺表面活性物質(zhì)，是生物物理功能所必需的，其破壞會影響正常肺的健康。SFTPC 基因變異可能會影響宿主對結(jié)核分枝桿菌的防御反應(yīng)，并導(dǎo)致活動性結(jié)核病患者出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)[18]。TGFB1、TLR2 信號通路和單核細(xì)胞功能和吞噬作用相關(guān)[19]。TGFB1 可增強(qiáng)局部的分枝桿菌抗菌能力[20]。TERT 為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。是目前疾病治療的新靶點之一。TERT 除了對癌癥的治療有作用還可通過PI3K-AKT、DNMT3B 及WNT/β-catenin 信號通路參與機(jī)體部分生理作用[21]。TNF信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在抗結(jié)核分枝桿菌進(jìn)程中起重要作用，可促進(jìn)趨化因子、INF-γ、TNF-α、IL-1 等的分泌，對于調(diào)節(jié)感染結(jié)核分枝桿菌后的細(xì)胞凋亡或壞死產(chǎn)生一定影響[22]。

從圖1中不難發(fā)現(xiàn)姜黃素、黃芩苷、蟲草素、穿心蓮內(nèi)酯、白黎醇素、木犀草素較其他中草藥活性成分在治療肺結(jié)核方面效果更好。姜黃素是一種二酮類化合物，主要存在于姜黃、莪術(shù)、娑羅子、山茱萸、當(dāng)歸、大棗等中草藥中，是一種有效的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，它是巨噬細(xì)胞用來殺死細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的一種效應(yīng)機(jī)制、也可保護(hù)人類巨噬細(xì)胞免受結(jié)核分枝桿菌感染，并與結(jié)核病預(yù)后相關(guān)[23-24]。黃芩苷是一種黃酮類化合物,主要存在于黃芩、半夏、半枝蓮、柴胡、木蝴蝶、雷公藤、馬尾蓮等中草藥中。黃芩苷是一種極好的的抗分枝桿菌藥物，同時又作為一種抗炎劑在臨床上廣泛使用，通過抑制PERK/TXNIP/NLRP3 軸減少細(xì)胞凋亡和抗分枝桿菌及抗炎作用[25-26]。蟲草素是一種核苷類化合物，存在于冬蟲夏草、茄根、藕節(jié)、大葉青、桃仁等中草藥中。蟲草素通過劫持細(xì)菌腺苷激酶殺死結(jié)核分枝桿菌[27]。穿心蓮內(nèi)酯為二萜內(nèi)酯類化合物，主要存在于蟬蛻、穿心蓮、沉香等中藥中，通過調(diào)節(jié)Notch1/Akt/NF-κB 軸在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用[28]。白黎醇素，一種非黃酮類多酚有機(jī)化合物，存在于虎杖、枸骨葉、花生衣、大黃、木通等之中，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，在抗結(jié)核分枝桿菌和治療結(jié)核病中具有一定療效[29-30]。白藜蘆醇通過干擾免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、促炎細(xì)胞因子的合成和基因表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫[31]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，主要存在于艾葉、八角茴香、萹蓄、北劉寄奴、敗醬草、燈心草等中草藥中。木犀草素可通過促進(jìn)中樞記憶T 細(xì)胞反應(yīng)來增強(qiáng)長期抗結(jié)核免疫，還可增強(qiáng)自然殺傷T 細(xì)胞的活性，并提供一種避免耐藥性發(fā)展、改善疾病癒后的方法[32-33]。

近年來發(fā)現(xiàn)，通過增強(qiáng)機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌的免疫防御、干擾結(jié)核分枝桿菌利用的機(jī)體機(jī)制、防止其在機(jī)體組織中持續(xù)或復(fù)制及靶向移動可能導(dǎo)致疾病或免疫病理的途徑對結(jié)核分枝桿菌有抗菌或抑菌治療效果[34]。本次通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測出12種中草藥活性成分主要通過肺結(jié)核通路、IL-17 信號通路、吞噬體通路、TGF-β 信號通路等和體液免疫反應(yīng)、IL6 產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、對革蘭氏陽性菌的防御反應(yīng)、對NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)節(jié)、JAK-STAT 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)等功能發(fā)揮增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高對結(jié)核分枝桿菌殺傷力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的吞噬、呈遞抗原的能力、減少肺上皮細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)等作用達(dá)到治療肺結(jié)核的目的。

通過分子對接結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在中草藥活性成分治療肺結(jié)核方面可聯(lián)合多種成分治療達(dá)到靶點覆蓋率及結(jié)合率最優(yōu)化以達(dá)到最佳的治療效果。本研究也存在一定不足之處，雖然通過生物信息學(xué)方法探索12 種了活性成分治療肺結(jié)核潛在作用機(jī)制，但基于不同數(shù)據(jù)庫收錄靶點基因、疾病基因以及算法等有諸多不同，因此本研究結(jié)果仍需要后期進(jìn)一步實驗驗證。