右美托咪定對橫紋肌溶解致急性腎損傷腎組織中MyD88和TRAF6蛋白的影響

趙文琪 張 震 夏洪蓮 范修穎 張月順▲

1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157000；2.南京明基醫(yī)院麻醉科，江蘇南京 210000

橫紋肌溶解癥（rhabdomyolysis，RM）本身作為一種臨床綜合征，是由物理、化學和生物等多種因素的共同作用，導致肌肉細胞破裂，肌紅蛋白、電解質和酶類被釋放到血液中，造成不同性質和程度的肌肉損傷，隨后各種實驗室和臨床檢查異常[1-2]。其最重要的并發(fā)癥之一是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），病死率高達8%，急性小管壞死和大量炎性細胞浸潤是RM誘導的AKI的主要病理特征[3]。研究表明，AKI的發(fā)生與TLR/MyD88/NF-κB通路緊密關聯(lián)[4-5]。但目前關于RM致AKI的具體作用機制尚少，基于此，本研究建立肌內注射甘油致大鼠AKI模型，并測定MyD88和TRAF6在大鼠腎臟組織中的表達。在大鼠肌內注射甘油前，給予右美托咪定（dexmedetomidine，DEX），觀察其對AKI的保護作用，以期為RM致AKI的臨床預防和治療提供思路。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

鹽酸右美托咪定（佑必妥，揚子江藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H20183219，規(guī)格：2 ml∶0.2 mg）；髓樣細胞分化因子 88（MyD88）和腫瘤壞死因子受體相關因子 6（TRAF6）兔抗鼠多克隆抗體（美國Santa公司）；HRP標記的山羊二抗（北京中杉金橋）；ECL化學發(fā)光試劑盒（南京恩晶生物科技有限公司）；ELISA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物與分組

SPF級健康雄性SD大鼠共45只，10周齡，體重200～220 g。隨機分為CN組、AKI組和DEX組，每組各15只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在22℃～26℃，喂食1周后開始實驗。本研究已得到牡丹江醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準（IACUC-20210104-2）。

1.3 動物模型的建立

每組大鼠禁食禁水24 h。除CN組外，其他各組肌內注射50%甘油，劑量為10 ml/kg，建立RM致AKI的大鼠模型。大鼠后腿腫脹僵硬，無法自由活動是成功用藥的標志。CN組大鼠在相同部位注射相同劑量的生理鹽水。DEX組中，造模前30 min腹腔注射30 μg/kg的DEX，在CN組和AKI組，同期腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

1.4 取材及標本處理

所有大鼠在造模后24 h選擇2%戊巴比妥鈉進行麻醉，取下腔靜脈血。靜置15 min，3000 r/min高速離心，取上清液，冷凍于-20℃的冰箱內。采血后，迅速摘除腎臟。將4%的多聚甲醛溶液注入左腎，固定24 h；右腎儲存在-80℃的超低溫冰箱里。

1.4.1 血清生化檢測 取凍存大鼠血清，使用ELISA試劑盒按試劑說明書檢測大鼠血清肌酐（creatinine，Cr）、血 尿 素 氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）濃度水平。

1.4.2 腎組織病理學觀察 取凍存腎組織進行石蠟包埋切片。進行HE染色，光學顯微鏡下（200×）觀察各組大鼠腎組織病理學變化。

1.4.3 Western blot法檢測腎組織中的MyD88和TRAF6的表達 凍存腎組織提取蛋白進行蛋白定量。對等量的蛋白質進行取樣，電泳轉移到PVDF膜上，稀釋的一抗將其密封，在4°C的搖床中孵化過夜。TBST清洗細胞膜，在與二抗孵化后，TBST再次洗膜，ECL顯色發(fā)光顯影，儀器觀察結果并保存圖像。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清BUN、Cr、CK比較

AKI和DEX組BUN、Cr、CK濃度均高于CN組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；DEX組BUN、Cr、CK水平低于AKI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、CK比較（x ± s）

2.2 腎臟組織病理學變化

大體觀：CN組大鼠雙腎表面光滑，形態(tài)飽滿，呈暗紅色，形狀類似于蠶豆，彈性良好，色澤正常；AKI組和DEX大鼠雙腎體積略有增大，充血水腫，顏色呈紫紅色，質脆易出血。DEX組好于AKI組，但與CN組比較雙腎腫大，顏色仍較暗。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟大體觀

HE染色顯示，CN組大鼠腎臟結構完整。甘油肌內注射后大鼠的病理變化主要發(fā)生在腎小管，鏡下顯示腎小管含有蛋白管型，空泡變性的現象，以及間質的炎性反應。DEX組和AKI組比較，損傷程度有所下降，但是與CN組比較仍然損傷明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織病理學變化（HE，200×）

2.3 各組大鼠腎組織MyD88、TRAF6蛋白水平比較

AKI組和DEX組MyD88、TRAF6蛋白水平高于CN組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；DEX組MyD88、TRAF6蛋白水平低于AKI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織MyD88及TRAF6的表達

3 討論

RM的特征是廣泛的骨骼肌纖維破壞及其內容物釋放到血液中，通過腎小球濾出并促進AKI的發(fā)展，其與RM高病死率和發(fā)病率相關[6-7]。其典型三聯(lián)征包括肌痛、乏力和深色尿[8]。本研究旨在評估DEX對大鼠的甘油誘導的RM致AKI的腎保護功效及可能機制。結果顯示腎損傷大鼠血清BUN、Cr顯著增加，同時伴隨著血清學RM相關生物標志物CK活性的增加，證明甘油注射造模成功。研究證實，Mb/CK比值是RM致AKI的預測因子，Mb/CK比值＞0.2時，RM致AKI的發(fā)生風險顯著增加[9]。本研究未對血清Mb值進行檢測，此為本研究的局限性之一。

RM致AKI的發(fā)病機制尚不完全清楚，研究表明炎癥反應與RM致AKI的發(fā)生和發(fā)展有關[10]。TLR信號通路介導的炎癥反應是AKI的重要致病因素[11]。在TLR信號通路傳導過程中，MyD88及TRAF6參與其中，與細胞內信號傳導途徑以及其他多種生物過程有關[12-14]。本研究采用Western blot法測定各組大鼠組織中MyD88及TRAF6的表達，發(fā)現肌肉甘油注射后其在腎組織表達顯著增加，提示MyD88及TRAF6與RM引起的AKI有關。

DEX作為干預藥物，其常用于臨床麻醉中，是一種對心臟、腎、腦器官的再灌注損傷有保護作用的鎮(zhèn)靜藥[15]。研究表明，DEX能減少炎癥因子的產生，從而減少器官缺血再灌注損傷[16]。但其在RM誘導的AKI中的作用及其對TLR/MyD88/TRAF6信號通路的影響尚無報道。Chen等[17]研究的干預方法，在大鼠后腿肌注甘油前，腹腔注射DEX 30μg/kg，顯示經DEX干預后，大鼠一般狀態(tài)較好，相比AKI組腎臟功能明顯好轉；電鏡下觀察大鼠腎臟的病理變化，DEX組和AKI組比較，損傷程度有所下降；與AKI模型組比較，MyD88和TRAF6的表達也顯著減少，這表明DEX可通過抑制炎癥反應減少腎損傷，且可能通過作用于MyD88 和 TRAF6靶點，阻斷 TLR 炎癥通路。本研究由于條件有限，未對大鼠腎小球濾過率及尿量進行具體監(jiān)測，為本研究的局限性之二。

綜上所述，甘油肌內注射的大鼠腎臟組織中表達了MyD88和TRAF6，提示二者都參與了RM致AKI，炎癥反應在損傷中起著重要作用；DEX的干預降低了腎組織中TRAF6和MyD88的表達，表明DEX通過降低TRAF6和MyD88的表達來抑制炎癥反應，這可能是DEX減輕RM致AKI的一個重要的保護機制。