PKM2基因在乳腺癌中的表達及臨床病理特征分析

殷 雷 齊 燕 黨相國 孫喜波 苗 鑫 胡瀟方 李湘奇▲

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科，山東泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)室，山東泰安 271000

乳腺癌現(xiàn)已成為威脅女性健康的主要疾病。近年來，發(fā)病年齡逐漸年輕化，發(fā)病率亦不斷上升。據(jù)2020年的全球癌癥統(tǒng)計，女性乳腺癌的發(fā)病率已超過肺癌成為最常見的癌癥，高達226萬例新增病例，占癌癥患者總數(shù)的11.7%[1-2]。2020年，在我國最常見的癌癥中，乳腺癌取代了肝癌排名第四，也成為中國女性中最常見的癌癥類型，新增病例數(shù)量從2015年的30萬增加到2020年的42萬，占全球乳腺癌的18%[3]。乳腺癌的靶向治療開啟了乳腺癌治療的新方向，但其治療效果差強人意。因此，探索乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在機制，尋找特異性的治療靶點是十分必要的。

腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞與正常細胞不同，可呈現(xiàn)出低脂狀態(tài)，即使在氧氣充足的條件下也會偏向使用糖酵解作用來取代正常細胞的有氧循環(huán)，這也是癌細胞的生長速度遠大于正常細胞的原因，即有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)[4-5]。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）是一種新的腫瘤生物標志物，可產(chǎn)生癌癥特異性的Warburg效應(yīng)，調(diào)節(jié)葡萄糖的快速攝入，參與了乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在乳腺癌組織中明顯升高，其表達水平與腫瘤分級呈正相關(guān)[6]。

近幾年，有關(guān)PKM2對腫瘤代謝作用的研究報道較多，但其在乳腺癌中作用的報道卻不甚詳盡，因此探討PKM2在乳腺癌組織中的表達，對了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，尋找乳腺癌治療的新靶點，具有重要的意義。本研究通過PCR技術(shù)檢測PKM2在乳腺癌及癌旁組織中的表達水平，并探討其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，為乳腺癌尋找新的治療靶點，或為改善其預(yù)后找出新的方向，以期為乳腺癌的治療提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2018年10月至2020年10月在山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（我院）收治的經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為原發(fā)性乳腺癌的患者。納入標準：①患者均接受手術(shù)治療；②患者入組前未行化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等；③患者有可測量病灶，癌組織直徑≥2 cm。排除標準：①病例資料不完整的患者；②患有乳腺良性腫瘤及精神疾病者；③妊娠期和哺乳期患者；④因各種主觀和客觀原因無法配合或退出研究的患者。符合標準的乳腺癌患者共63例，年齡33～84歲，中位年齡為51歲。根據(jù)2022年《中國臨床腫瘤學(xué)會乳腺癌診療指南》中關(guān)于絕經(jīng)的標準[7]：絕經(jīng)前狀態(tài)患者49例，絕經(jīng)狀態(tài)患者14例。左乳腺癌34例，右乳腺癌28例，雙乳癌1例。所有研究對象在手術(shù)完成后，在完整大標本上從腫瘤中心向外切取部分癌組織（約1.0 cm×1.0 cm），在距癌組織邊緣至少＞5 cm處切取癌旁組織（約1.0 cm×1.0 cm），放入液氮，用于PCR檢測；遠處轉(zhuǎn)移主要依據(jù)影像學(xué)檢查CT、MRI結(jié)合核醫(yī)學(xué)骨掃描等情況以及患者隨訪期間轉(zhuǎn)移病灶情況綜合判定。本研究獲我院醫(yī)學(xué)和科研倫理委員會批準。

1.2 臨床病理參數(shù)

63例乳腺癌患者根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第七版的TNM分期標準[8]：腫瘤大小為T1（直徑≤2 cm）患者19例，腫瘤大小為T2（2 cm＜直徑≤5 cm）患者38例，腫瘤大小為T3（直徑＞5 cm）患者6例。Ⅰ期患者13例，Ⅱ期32例，Ⅲ期及以上18例。腫瘤增殖指數(shù)（Ki-67）：低Ki-67（≤30%）34例；高Ki-67（＞30%）29例。以影像學(xué)資料及術(shù)后病理為標準，有臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例，無臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者28例。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取及Real-time PCR 使用Thermo Fisher Scientific公司Trizol試劑盒從細胞中提取總RNA，然后使用天根生物科技有限公司產(chǎn)品Quant script RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，進行RT檢測。通過以下引物檢測PKM2 RNA水平上的表達情況，F(xiàn)：5’-AAGGGTGTGAACCTTCCTGG-3’；R：5’-GCTCGACCCCAAACTTCAGA-3’。數(shù)據(jù)以GAPDH標準化后的相對表達水平顯示。GAPDH，F(xiàn)：5’-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3’；R：5’-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3’。PCR反應(yīng)體系中含2×SuperReal Pre Mix Plus 5 μl，正向引物（10 μm）0.3 μl，反向引物（10 μm）0.3 μl，cDNA模板1 μl，RNase-free dd H2O 3.4 μl，總體積10 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 15 min，變性95℃ 20 s，退火56℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，40個循環(huán)。提取實驗CT值，進行結(jié)果處理。

1.3.2 結(jié)果判斷 提取實驗CT值，進行結(jié)果處理。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標基因，待測樣本），B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標基因，對照樣本），K=A-B，表達倍數(shù)=2-K。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism V 9.4軟件和SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，正態(tài)分布或方差齊性采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

PKM2 mRNA在乳腺癌組織中的表達量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；低Ki-67組、高Ki-67組、淋巴結(jié)陰性組、淋巴結(jié)陽性組PKM2 mRNA在乳腺癌組織中的表達量均高于乳腺癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；在乳腺癌組織中，高Ki-67組表達高于低Ki-67組，淋巴結(jié)陽性組表達高于淋巴結(jié)陰性組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1、圖1～3。

表1 PKM2在乳腺癌組織及乳腺癌旁組織中的表達量比較（x ± s）

圖1 PKM2 mRNA相對表達量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001）

圖2 亞組分析中Ki-67組PKM2 mRNA相對表達量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001）

圖3 亞組分析中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PKM2 mRNA相對表達量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001)

3 討論

乳腺癌具有高度的異質(zhì)性，無論在免疫表型、組織形態(tài)還是生物學(xué)行為方面都具有很大的差異，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機制很復(fù)雜，與很多特異性腫瘤相關(guān)因子及復(fù)雜的信號通路有關(guān)，這決定了其預(yù)后也受多方面因素的影響，因此，目前迫切需要找到新的預(yù)后指標或治療靶點，來指導(dǎo)乳腺癌的治療。

PKM2可產(chǎn)生癌癥特異性的Warburg效應(yīng)，參與乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。它由四個相同的亞基形成四聚體蛋白，每個亞基（或單體）包含四個結(jié)構(gòu)域，包括A、B、C和N端結(jié)構(gòu)域。單體首先二聚在一起，然后兩個二聚體再形成四聚體，這四種同工酶通常都以高活性的四聚體形式存在[9]。而腫瘤生長因子可激活PKM2磷酸化位點，使其處于低活性的二聚體狀態(tài)，從而使乳腺癌細胞維持糖酵解表型，進入旁路代謝途徑進行生物合成；二聚體狀態(tài)的PKM2也可由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細胞核內(nèi)，參與癌細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及信號傳導(dǎo)等過程，并作為蛋白激酶磷酸化特殊的核蛋白，從而調(diào)控基因的表達，促進癌細胞的生長[10]。

腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在乳腺癌組織中表達上調(diào)，與其預(yù)后不良相關(guān)，并可通過促進癌細胞活力和侵襲能力來調(diào)控腫瘤進展，從而促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[11]。PKM2在體內(nèi)和體外均可以負向調(diào)節(jié)組蛋白H2B單素化（H2Bub1）的水平，通過部分控制H2Bub1實現(xiàn)了致瘤功能。PKM2-H2Bub1軸可能成為一個有前景的癌癥治療靶點[12]。5-羥色胺可通過分別觸發(fā)Jak1/STAT3/ERK1/2和腺苷酸環(huán)化酶/PKA兩種不同的信號通路上調(diào)PKM2，從而促進糖酵解及乳腺癌細胞的增殖和代謝[13]。有研究顯示[14]，PKM2高表達的新輔助化療患者的總生存期明顯短于PKM2低表達的患者。通過調(diào)控PKM2泛素化和降低PKM2穩(wěn)定性可以介導(dǎo)乳腺癌中紫杉類藥物耐藥的新信號通路[15]。此外，PKM2抑制劑聯(lián)合他莫昔芬有可能逆轉(zhuǎn)乳腺癌患者他莫昔芬耐藥[16]。因此，可以通過檢測腫瘤的PKM2蛋白表達來預(yù)測乳腺癌的預(yù)后和對化療及內(nèi)分泌治療的敏感性[14]。但也有研究顯示，雖然PKM2的敲除會降低癌細胞的生長，但PKM2的敲除會加速同種異體移植腫瘤的生長，從而揭示了PKM2在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和癌變中的細胞自主和系統(tǒng)性作用[17]?？傊琍KM2在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，有可能成為一個潛在的乳腺癌生物標志物和治療靶點。

本研究結(jié)果顯示，檢測的乳腺癌組織中，PKM2為（1.64±0.06），在乳腺癌中的表達量高于癌旁組織，證明了PKM2作為促癌基因，可在癌組織中高表達，這對預(yù)測乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及篩查具有一定的意義。PKM2基因在高Ki-67和淋巴結(jié)陽性的乳腺癌組織中表達較高，提示PKM2與乳腺癌病情進展也許存在關(guān)系，但仍需大數(shù)量樣本做進一步研究。

綜上所述，PKM2無論腫瘤組織增殖水平高低、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織間的表達水平均存在差異。本研究存在一定的不足，樣本量較少，且來源單一，未能涉及所有類型乳腺癌，且不同臨床病理參數(shù)做比較時，樣本量存在偏倚，存在不可比較的可能性，因此，PKM2可能作為預(yù)測乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的潛在性標志，但仍需進一步研究。隨著對PKM2研究的深入，對其在細胞質(zhì)和細胞核中獨特的生物學(xué)效應(yīng)的研究將為乳腺癌的治療提供更廣闊的道路，PKM2很可能成為新的潛在靶點，靶向PKM2的藥物也將在乳腺癌的治療中發(fā)揮更大的作用。