香茅精油微膠囊的制備及表征分析

臧芳波，李沖，韓雪，馮隨，時若棟，高曉光*

(1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，石家莊 050018；2.河北雙鴿食品股份有限公司，石家莊 050021；3.河北省生豬加工技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050021)

香茅,又稱檸檬草,味辛,性溫,常生長于我國熱帶地區(qū),如廣東、海南、臺灣,在東非和西印度群島也有栽培[1]。香茅精油是從曬干的香茅莖葉中提取得到的油狀物質(zhì)。大多數(shù)香茅精油能檢測出20～40種活性成分,其中香茅醛、香茅醇、香葉醇和橙花醇最為常見[2]。香茅精油具有抗菌、抗氧化、驅(qū)蟲、抗驚厥等作用[3],常被用于驅(qū)蚊劑、肥皂、香水或食品添加劑[4]。但由于其穩(wěn)定性較差，易氧化分解，有明顯的獨特氣味,導(dǎo)致其在食品行業(yè)中的應(yīng)用受到限制。將精油包埋在由多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等壁材構(gòu)成的微膠囊中,能提高精油的穩(wěn)定性,掩蓋其特殊氣味,是擴(kuò)大精油應(yīng)用范圍的一個重要手段[5]。

單個顆?；蛞旱蔚墓腆w或液體材料(芯材)被聚合物材料(壁材)的連續(xù)薄膜包裹或覆蓋,產(chǎn)生幾微米到幾毫米大小的微粒膠囊的過程,稱為微膠囊化[6]。微膠囊能有效提高被包埋物質(zhì)(芯材)的穩(wěn)定性,且可控制芯材釋放,使其緩慢釋放或在機(jī)械作用、pH 變化、酶催化、超聲作用和鹽類等刺激下快速釋放[7-8]。目前,微膠囊技術(shù)已被應(yīng)用在紡織業(yè)[9]、醫(yī)療藥物[10]、食品[11]、農(nóng)藥用品[12]等多個領(lǐng)域。殼聚糖是一種具有良好生物相容性和可降解性的天然堿性多糖,由甲殼素脫乙?；鴣韀13]。研究表明,殼聚糖還具有一定的抑菌作用,可以通過抑制三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性,導(dǎo)致菌體死亡[14]。酸性條件下,殼聚糖中的游離氨基被陽離子化,并與帶負(fù)電物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用形成微膠囊。

本研究以香茅精油為芯材,殼聚糖和三聚磷酸鈉為壁材,采用離子交聯(lián)法制備香茅精油微膠囊,通過粒度分布儀、掃描電鏡、傅里葉紅外光譜、熱重分析儀對其粒徑、形貌、熱穩(wěn)定性等表征進(jìn)行分析,并研究了其包埋率、抑菌和抗氧化活性以及緩釋性能,為香茅精油微膠囊在食品中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香茅精油:水蒸氣蒸餾法提取,自制;殼聚糖:阿拉丁試劑有限公司;三聚磷酸鈉:上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;冰醋酸、氫氧化鈉、吐溫80、氯化鈉:天津市永大化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白胨、酵母浸粉:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;無水乙醇:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME 104/02電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;78-1磁力加熱攪拌器 常州榮華儀器制造有限公司;ST2200ZH pH 計 奧豪斯儀器有限公司;LGJ-10D冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;SPECTRO star Nano 酶標(biāo)儀 香港伯齊生物科技有限公司;UV-5800紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;STD-2960差熱-熱重聯(lián)用熱分析儀 美國TA 儀器公司;S-4800-Ⅰ場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日立科學(xué)儀器(北京)有限公司;BT-9300S激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司;TG16臺式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香茅精油微膠囊的制備

參考姚潔玉等[15]的方法,并稍作修改。將殼聚糖溶于1%的醋酸溶液,攪拌后過夜。用2 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 值至4，制成2 mg/mL的殼聚糖溶液。加入體積1%的吐溫80,攪拌1 h后冷卻至常溫,得殼聚糖-吐溫80混合溶液,備用。將香茅精油溶于無水乙醇制成的精油醇溶液中,并滴入殼聚糖-吐溫80混合溶液中,攪拌1 h后再滴入1.5 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液,繼續(xù)攪拌1 h,使其充分交聯(lián)。于10 000 r/min 離心15 min,棄去上清液,取下層于-80 ℃真空凍干。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

將香茅精油稀釋至合適濃度進(jìn)行全波長掃描,測定最大吸收波長為260 nm。

將香茅精油用無水乙醇配制成1 mg/mL的母液,然后分別吸取1,3,5,7,9 mL母液,定容至10 mL后,使待測液濃度分別為0.1,0.3,0.5,0.7,0.9 mg/mL。以無水乙醇為空白對照,在260 nm(最大吸收波長)處測定吸光值。重復(fù)3次取平均值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。R2=0.999 4,表示線性關(guān)系良好。

圖1 香茅精油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of citronella essential oil

1.3.3 包埋率測定

準(zhǔn)確稱取0.10 g凍干后的香茅精油微膠囊粉末,溶于無水乙醇,并定容至100 mL,超聲30 min后靜置,于260 nm處測定吸光值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度,通過下式計算包埋率:

包埋率=包埋的香茅精油質(zhì)量/加入的總香茅精油質(zhì)量×100%。

1.3.4 粒徑分布

通過BT-9300S激光粒度分布儀測定，分散介質(zhì)為超純水[16]。開啟循環(huán)泵,待提示后將樣品緩慢加入到樣品池中。儀器顯示“濃度正常,可以使用”時停止加樣,待遮光率穩(wěn)定在10左右時,點擊“連續(xù)”進(jìn)行樣品的測定,儀器自動測試3次并取平均值。遮光度為5%～15%,樣品折射率為1.52,吸收率為0.1,介質(zhì)折射率為1.333,采用體積分布進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。Span值表示微膠囊顆粒的均一性,Span值越小,表明均一性越好。

Span=(D90-D10)/D50。

式中：D10為累積分布10%的顆粒直徑，μm；D50為累積分布50%的顆粒直徑，μm；D90為累積分布90%的顆粒直徑，μm。

1.3.5 掃描電鏡分析

用毛細(xì)管蘸取微膠囊粉末,用導(dǎo)電膠將其固定在載物臺上,通過離子噴涂機(jī)進(jìn)行噴金。調(diào)整不同倍數(shù)觀察樣品形態(tài)[17]。

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析

掃描波長為500～4 000 cm-1,對香茅精油、香茅精油微膠囊、殼聚糖進(jìn)行光譜分析。

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

準(zhǔn)確稱取10 mg樣品,并將其放入坩堝內(nèi),用氦氣作為保護(hù)氣,流速為20 mL/min,加熱速率為10 ℃/min[18]。

1.3.8 抑菌率測定

采用混菌法測定。稱取0.10 g香茅精油微膠囊凍干粉末,紫外滅菌30 min備用。取1 mL菌懸液與9 mL 無菌生理鹽水在試管中混勻,加入紫外滅菌后的香茅精油微膠囊凍干粉末反應(yīng)10 min?？瞻捉M不加香茅精油微膠囊凍干粉末。吸取100 μL處理液用涂布器將菌液均勻分布在已凝固的LB固體培養(yǎng)基表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

抑菌率(%)=(A-B)/A×100。

式中：A為空白組的菌落數(shù)；B為處理組的菌落數(shù)。

1.3.9 DPPH 自由基清除率

將2 mL樣品和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液振蕩混勻,避光反應(yīng)30 min,于517 nm 處測定吸光值,BHT為陽性對照[19]。

DPPH清除率(%)=(A1-A+A2)/A1。

式中:A為2 mL樣品+2 mL DPPH 的吸光值;A1為2 mL DPPH+2 mL乙醇的吸光值;A2為2 mL 樣品+2 mL乙醇的吸光值。

1.3.10 香茅精油微膠囊釋放性能研究

參考GB 31604.1—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》中的食品模擬體系,選取以下食品模擬體系:水包油食品:50%乙醇;脂類食品:95%乙醇。25 ℃恒溫水浴輕微振蕩,在第0,3,6,12,24,36,48,60,72 h時取樣,并補(bǔ)充釋放介質(zhì),離心后取上清液測定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)3次,結(jié)果用Origin 2021處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香茅精油微膠囊包埋率

香茅精油微膠囊包埋率是指被包埋的香茅精油質(zhì)量與添加的總香茅精油質(zhì)量的比值。被包埋的香茅精油越多,包埋率越高。本次試驗條件下的包埋率為(92.24±0.52)%,說明絕大部分的香茅精油能夠被有效包埋。

2.2 香茅精油微膠囊粒徑及粒徑分布

微膠囊的流動性、溶解性和分散性都直接受到顆粒大小及均勻性的影響,香茅精油微膠囊粒徑分布圖見圖2。香茅精油微膠囊粒徑大小在微米范圍內(nèi),呈正態(tài)分布,主要分布在10～30 μm 之間,平均粒徑為16.76 μm。D10為5.37 μm,中位徑D50為15.47 μm,D90為30.71 μm,計算得到的Span值為1.64,樣品均一性較好。

圖2 香茅精油微膠囊粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of citronella essential oil microcapsules

2.3 香茅精油微膠囊的形貌特征

圖3 香茅精油微膠囊掃描電鏡圖Fig.3 SEM image of citronella essential oil microcapsules

由圖3可知,香茅精油微膠囊呈小球狀,大小分布較均勻。有的顆粒粘連在一起,可能是因為殼聚糖具有一定的黏性,從而使得微膠囊團(tuán)聚在一起。掃描電鏡圖顯示,香茅精油微膠囊的粒徑大約在50～150 nm 之間,比粒徑分布儀得到的結(jié)果要小,可能是由于用粒徑分布儀測定時,樣品分散在水中,發(fā)生了溶脹現(xiàn)象,而掃描電鏡觀察的樣品是凍干以后的粉末。Hasheminejad 等[20]比較了丁香精油微膠囊在掃描電鏡下和分散在水中時的粒徑大小,與本研究結(jié)果一致。

2.4 香茅精油微膠囊的紅外表征

圖4 香茅精油、殼聚糖和香茅精油微膠囊紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of citronella essential oil, chitosan and citronella essential oil microcapsules

2.5 香茅精油微膠囊熱穩(wěn)定性分析

溫度在50～600 ℃范圍內(nèi),殼聚糖和香茅精油微膠囊的熱重分析曲線見圖5。

圖5 殼聚糖、香茅精油、香茅精油微膠囊熱重分析圖Fig.5 Thermogravimetric analysis of chitosan, citronella essential oil and citronella essential oil microcapsules

由圖5可知,香茅精油分解速度極快,在60 ℃左右就開始分解,117 ℃時分解最快,180 ℃時質(zhì)量損失為98.71%,因此需要采取一定措施來保護(hù)揮發(fā)性的香茅精油。殼聚糖的失重分為兩個階段:50～110 ℃時主要為殼聚糖中結(jié)合水的揮發(fā),失重為1.12%,隨著溫度的升高,殼聚糖發(fā)生熱分解,298 ℃達(dá)到最大分解速度。香茅精油微膠囊的失重主要有3個階段:50～109 ℃時質(zhì)量損失為3.94%,此時主要是微膠囊中結(jié)合水以及表面殘留的部分精油揮發(fā);206～263 ℃時,壁材的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂,香茅精油得以逸出并揮發(fā),此階段的質(zhì)量損失為22.5%,與香茅精油相比,微膠囊內(nèi)的精油失重溫度右移,且揮發(fā)速率減慢,表明香茅精油被包埋進(jìn)壁材內(nèi),成功得到了保護(hù);溫度高于263 ℃時剩下的香茅精油繼續(xù)揮發(fā),同時壁材也開始分解碳化。香茅精油微膠囊在253 ℃時達(dá)到最大分解速度,可以滿足大多數(shù)加工運(yùn)輸和儲藏環(huán)境要求,保持性質(zhì)穩(wěn)定。

2.6 香茅精油微膠囊抑菌性分析

香茅精油微膠囊對供試菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果見表1。

表1 香茅精油微膠囊對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率Table 1 Inhibitory rate of citronella essential oil microcapsules against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表1可知,香茅精油微膠囊對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有非常顯著的抑制效果,特別是對大腸桿菌。當(dāng)香茅精油微膠囊濃度為4 mg/mL時,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率分別為94.64%和97.44%,濃度為6 mg/mL時能完全抑制供試菌株生長。香茅精油微膠囊有如此好的抑菌效果主要是因為其芯材中含有醛類、醇類等有抑菌效果的活性成分,同時所用的壁材殼聚糖也被證實具有一定的抑菌性。

2.7 香茅精油微膠囊抗氧化性分析

圖6 香茅精油微膠囊DPPH 清除率Fig.6 DPPH scavenging rate of citronella essential oil microcapsules

由圖6可知,隨著香茅精油微膠囊和BHT 濃度的增加,DPPH 自由基清除率均逐漸增大。香茅精油微膠囊濃度為2 mg/mL時,DPPH 清除率為78.61%。當(dāng)濃度增加到10 mg/mL 時,DPPH 清除率可達(dá)到98.32%,表現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化能力。整個實驗過程中,香茅精油微膠囊的自由基清除能力雖始終弱于商業(yè)抗氧化劑BHT,但隨著濃度的增加,兩者清除自由基能力的差距逐漸縮小。

2.8 香茅精油微膠囊釋放性能分析

不同食品模擬體系中,香茅精油微膠囊的釋放曲線見圖7。

圖7 香茅精油微膠囊釋放曲線Fig.7 Release curve of citronella essential oil microcapsules

由圖7可知,室溫第3天時,香茅精油微膠囊在水包油食品和脂類食品中尚未完全釋放,累積釋放率分別為86.74%和89.31%,且釋放速率曲線逐漸變緩。表明微膠囊處理后香茅精油揮發(fā)性一定程度上得以改善,有利于其持續(xù)使用。

3 結(jié)論

通過離子交聯(lián)法制得的香茅精油微膠囊包埋率為92.24%,結(jié)合紅外光譜分析結(jié)果可知,絕大部分香茅精油能得到有效包埋。制得的香茅精油微膠囊呈小球狀,表面光滑,有團(tuán)聚現(xiàn)象。粒徑大小在50～150 nm之間,呈正態(tài)分布,均一性較好。具有較強(qiáng)的抑菌和抗氧化作用,且作用效果具有一定的劑量依賴性。香茅精油經(jīng)微膠囊技術(shù)處理后,熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性得到改善,可以滿足大多數(shù)加工運(yùn)輸和儲藏環(huán)境要求。