花青素對慢性炎性痛大鼠中樞TRPV1表達的影響

張祥濤，趙辰爽，謝聰穎，熊彬睿，陳雪梅，李 慧，余恬恬，王 靜

(皖南醫(yī)學院 1.藥學院；2.研究生學院；3.檢驗學院；4.基礎醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002)

慢性疼痛是臨床常見病癥，治療難度大且療效不佳，嚴重影響人類生活質量[1]。促炎和抗炎細胞因子失衡導致的炎癥是慢性痛發(fā)生發(fā)展的關鍵原因[2]，中樞瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)同時參與慢性痛外周敏化和疼痛中樞調控，在慢性炎性痛中具有重要作用[3-4]?；ㄇ嗨?anthocyanin,Ant)是一類天然水溶性色素，廣泛存在于各種植物的花、果和葉片中，如藍莓、桑葚、金葉女貞等。Ant具有較強的抗氧化、抗衰老、抗炎、抑菌等多種功效，能降低體內的氧化應激和炎癥水平[5-7]，課題組前期研究也證實Ant的抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛作用[8-9]。Ant可通過血腦屏障到達中樞，抑制氧化應激和神經炎癥從而對神經系統(tǒng)發(fā)揮保護作用[10-11]。本研究擬用完全弗氏佐劑(complete freund′s adjuvant,CFA)誘導經典的慢性炎性痛模型，觀察Ant對CFA誘導的慢性炎性痛作用效果，為開發(fā)Ant治療慢性炎性痛藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 藥品與試劑 CFA，sigma公司；Ant提取自金葉女貞果實，經烘干、過篩、提取、吸附，去糖去脂得100%純Ant粉末，生理鹽水配制成溶液使用；TRPV1一抗(abcam公司，ab10296)，二抗(博士德公司，SV0002)。

1.3 實驗儀器 熱刺痛儀(PL-200，成都泰盟科技有限公司)；電子壓痛儀(BW-YLS-3E，上海軟隆科技公司)；足趾容積測量儀(YLS-7B，上海軟隆科技公司)。

1.4 實驗動物分組 30只大鼠常規(guī)適應飼養(yǎng)1周后隨機分為3組(n=10)，對照組：左后肢足底皮下注射生理鹽水100 μL；模型組：左后肢足底皮下注射CFA 100 μL誘導慢性炎性痛模型；Ant組(Ant)：左后肢足底皮下注射CFA 100 μL，同天開始Ant(根據前期實驗摸索Ant濃度為90 mg/kg)灌胃1周。

1.5 慢性炎性痛模型建立 依據文獻[12]建造慢性炎性痛模型，經行為學觀察和痛覺評分，造模成功率100%。

1.6 痛行為觀察及分析評價 模型組和Ant組大鼠在注射CFA后1、15、30 min及1、3、5、7 d共7個時間點，按文獻[13]標準記錄疼痛評分。

1.7 大鼠體質量監(jiān)測 清晨大鼠在清醒、安靜狀態(tài)下，于實驗開始前和術后1、3、5、7 d相同時間點測量各組大鼠體質量。

1.8 足趾容積測量 清晨大鼠在清醒、安靜狀態(tài)下，用足趾容積測量儀在實驗開始前和術后1、3、5、7 d相同時間點測量大鼠左側后足趾容積。

1.9 熱痛閾值和機械痛閾值檢測 參照文獻[9]在造模前和造模后1、3、5、7 d測定各組大鼠的熱痛閾值(heat pain threshold，HPT)和機械痛閾值(mechanical pain threshold，MPT)。

1.10 炎性因子檢測 ELISA法檢測血清和炎癥部位PGE2、TNF-α、IL-6含量，具體方法按試劑盒說明進行。

1.11 中樞TRPV1蛋白表達檢測 Western blot檢測中樞丘腦、藍斑、海馬區(qū)TRPV1表達，TRPV1條帶灰度值與內參蛋白β-actin條帶的灰度值之比表示TRPV1表達量，再以對照組TRPV1表達量為1，計算模型組和Ant組TRPV1的相對表達量。

2 結果

2.1 Ant對慢性炎性痛大鼠體質量的影響 各組大鼠體質量緩慢增長，且3組大鼠體質量增長速度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 CFA誘導的慢性炎性痛大鼠痛行為評分 模型組和Ant組大鼠在注射CFA后即刻引發(fā)痛覺行為，均出現(xiàn)尖叫、躁動不安、注射足不敢觸地、舔舐注射足及抖動注射足等現(xiàn)象。時間與分組對痛行為評分存在交互效應，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比，Ant組注射CFA后5 d痛行為評分開始降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3 Ant對慢性炎性痛大鼠足趾容積的影響 時間與分組對足趾容積變化存在交互效應，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對照組大鼠足趾容積無明顯變化，模型組和Ant組大鼠在注射完CFA 1 d后足趾容積明顯增大(見圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比，Ant組在注射CFA 7 d足趾容積減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 Ant對慢性炎性痛大鼠體質量的影響

表2 注射CFA后不同時間點大鼠疼痛評分

表3 Ant對慢性炎性痛大鼠足趾容積的影響

圖1 CFA誘導慢性炎性痛大鼠左后肢腫脹圖

2.4 Ant對慢性炎性痛大鼠HPT的影響 時間與分組對HPT變化存在交互效應，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組和Ant組在注射CFA后，HPT明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，Ant組在注射CFA后5 d HPT開始回升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表4。

2.5 Ant對慢性炎性痛大鼠MPT的影響 時間與分組對MPT變化存在交互效應，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組和Ant組在注射CFA后1 d MPT下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Ant組在注射CFA后5 d與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表5。

2.6 Ant對慢性炎性痛大鼠血清及足趾浸浴液的炎性因子影響 與對照組相比，模型組的大鼠血清和足趾浸浴液中PGE2、TNF-α、IL-6均升高(P<0.01)；與模型組相比，Ant組的大鼠血清和足趾浸浴液中PGE2、TNF-α、IL-6均降低(P<0.05)，見表6。

2.7 Ant對慢性炎性痛大鼠中樞TRPV1表達的影響 與對照組相比，模型組大鼠中樞丘腦、海馬、藍斑TRPV1蛋白表達均增加(P<0.01)；與模型組相比，Ant降低了中樞丘腦(P<0.05)、海馬(P<0.05)、藍斑(P<0.01)TRPV1蛋白表達，見圖2。

表4 Ant對慢性炎性痛大鼠HPT的影響

表5 Ant對慢性炎性痛大鼠MPT的影響

表6 Ant對慢性炎性痛大鼠血清及足趾浸浴液中炎性因子影響

與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

組織器官在受到傷害性刺激時會出現(xiàn)典型的紅、腫、熱、痛等局部炎癥反應；炎癥嚴重時會伴有發(fā)燒、白細胞增多、毛細血管通透性增加等癥狀。本研究用CFA誘導經典慢性炎性痛模型，注射CFA后動物即刻引發(fā)痛覺行為，出現(xiàn)躁動不安、注射足不敢觸地、舔舐注射足及抖動注射足等痛覺行為，局部組織周圍出現(xiàn)紅腫、痛覺過敏持續(xù)一周。

TRPV1屬于瞬時受體通道的一個亞型，廣泛表達于外周感覺神經元和大多腦區(qū)中，包括所有的皮質區(qū)，部分邊緣系統(tǒng)(海馬、中央杏仁核)、藍斑、下丘腦及黑質。TRPV1作為痛覺信息傳遞系統(tǒng)的第一站，能被多種傷害性刺激激活，包括辣椒素、高熱、機械以及疼痛等，激活后引起Na+、Ca2+、Mg2+等陽離子跨膜移動，并將其轉換為動作電位向脊髓、丘腦及高位腦中樞傳遞并最終產生痛覺，同時伴隨降鈣素基因相關肽、P物質(Substance P,SP)等神經遞質的釋放參與神經源性炎癥反應[14]。而炎性因子如SP、神經生長因子、PGE2、緩激肽等也可以通過激活G蛋白耦聯(lián)受體致敏TRPV1，導致TRPV1通道閾值降低，從而放大疼痛和產生炎癥[15-17]。TRPV1與炎性因子形成互相促進的效應，加劇了痛覺感受，本研究也證實了這一結果，Ant組大鼠從丘腦至海馬、藍斑區(qū)域的TRPV1表達均有降低，這可能與Ant降低炎性因子釋放有關，從而緩解痛覺感受。

研究發(fā)現(xiàn)TRPV1被激活后雖然暫時引起劇痛，但長時間激活后卻能抑制后續(xù)的疼痛。所以TRPV1的抑制劑和強激動劑都有可能成為止痛藥的研究對象[18]。Ant的抗炎、鎮(zhèn)痛作用已初現(xiàn)端倪，但其機制仍不十分明確；本研究證實了Ant可能通過抑制TRPV1表達發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，為開發(fā)Ant的鎮(zhèn)痛作用提供了理論基礎，本課題組將繼續(xù)研究Ant如何通過TRPV1通道發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。