兼具抗菌及促細(xì)胞黏附特性的鈦表面光熱涂層的研究

陸軍 曾德良

光熱療法（PTT）被視為一種替代抗生素的細(xì)菌感染控制策略[1-2]。光熱納米顆粒在適當(dāng)?shù)慕t外光（NIR）輻照下被激活，可局部釋放熱量[3]。PTT 的顯著優(yōu)勢(shì)就是抗菌效果具有較強(qiáng)的普適性，對(duì)菌株的革蘭氏菌特征或抗生素耐藥性沒有明顯區(qū)分。臨床上，細(xì)菌感染很少由浮游細(xì)菌引起，主要由生物膜生長(zhǎng)模式中的細(xì)菌引起，細(xì)菌通過基質(zhì)產(chǎn)生黏附并適應(yīng)基質(zhì)表面[4]。植入物術(shù)后感染，如因侵入性手術(shù)或創(chuàng)傷引起的感染[5]，是生物材料植入失敗的主要原因，因?yàn)橹踩胛锵嚓P(guān)感染難以用抗生素等抗菌藥物有效控制[6]。據(jù)報(bào)道，基于光熱納米顆粒的PTT 技術(shù)需要將其富集到感染部位并進(jìn)行近紅外輻射，方能產(chǎn)生更好的效果[7-9]。若將光熱納米顆粒用作植入物的涂層，則可保證光熱納米顆粒直接接觸感染部位，從而提升PTT 療效，有效控制感染。然而，通過近紅外輻射殺死植入物表面上的細(xì)菌對(duì)植入物周圍的細(xì)胞及組織也可能造成附帶損害。尋求植體表面的抗菌光熱涂層，同時(shí)也須強(qiáng)調(diào)涂層對(duì)周圍細(xì)胞黏附及組織整合的保護(hù)與促進(jìn)作用。本研究中，我們?cè)阝伇砻嬷苽淞丝杀籒IR 激活的聚多巴胺納米顆粒（PDA-NP）涂層，進(jìn)一步驗(yàn)證了其用于預(yù)防和治療生物材料相關(guān)感染并維持組織整合的潛能。臨床上，植入物組織整合的成敗受到金黃色葡萄球菌（S.aureus）感染的挑戰(zhàn)，因此本研究選擇S.aureus 作為病原體，因其是種植體周圍炎的主要致病病原體[10]。PDA-NP 具有良好的生物相容性、生物降解能力和較強(qiáng)的近紅外吸收能力而被選擇用作鈦表面涂層[11-13]。本研究通過細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)的模型評(píng)估鈦表面的PDA-NP 涂層殺菌效果和細(xì)胞黏附效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

直徑10 mm、厚度1 mm 的生物醫(yī)用級(jí)Ti6Al4V圓盤材料（中國寶雞君航金屬材料有限公司）。NH4OH，無水乙醇，KOH 和鹽酸多巴胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FITC-phalloidin、DAPI 和CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。小鼠前成骨細(xì)胞系（MC3T3-E1）購自中科院細(xì)胞庫。

掃描電子顯微鏡（復(fù)納科學(xué)儀器上海有限公司），紅外成像攝像機(jī)（Fluke TiX580，荷蘭），多功能全波長(zhǎng)微孔板讀取器（Multiskan GO，Thermo Fisher Scientific，美國），熒光顯微鏡拍照分析（Leica DM4000，Leica Microsystems Ltd.，德國）。

1.2 方法

1.2.1 鈦表面光熱PDA-NP 涂層的制備及其表征

鈦表面首先經(jīng)堿熱處理：將鈦片置于含有4 mol/L的KOH 溶液的反應(yīng)釜中，80 ℃恒溫反應(yīng)2 h，自然冷卻至室溫，取出鈦片，去離子水沖洗后干燥，處理完后的鈦片標(biāo)記為Ti。

在堿熱處理后的鈦表面合成光熱納米顆粒PDA-NP：7 mL NH4OH（28%～30%）與40 mL 無水乙醇和90 mL 超純水室溫下攪拌30 min。然后，向溶液中添加10 mL 多巴胺（50 mg/mL）溶液，并在30℃下攪拌24 h，將上述Ti-OH 鈦片置于溶液內(nèi)以形成PDA 納米顆粒。用96%乙醇洗滌3 次，并用去離子水清洗3 次，在60 ℃的烘箱中干燥樣品。處理后的鈦片標(biāo)記為Ti-PDA。

使用掃描電子顯微鏡（SEM），加速電壓10 kV，檢測(cè)鈦樣品上PDA-NP 涂層的形貌。表面噴涂10 nm厚的金層。

1.2.2 鈦表面PDA-NP 涂層的光熱效應(yīng)

為了確定鈦表面PDA-NP 涂層的光熱效應(yīng)，在808 nm（Thorlabs，Newton，NJ）下以1 W/cm2的功率密度進(jìn)行近紅外輻射3 min。在輻照期間，使用紅外成像攝像機(jī)記錄溫度，完成整個(gè)樣品表面成像。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

使用小鼠前成骨細(xì)胞系（MC3T3-E1）對(duì)Ti-PDA 進(jìn)行體外評(píng)價(jià)，并與Ti 進(jìn)行比較。在37 ℃下，使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基在加濕環(huán)境中，37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。樣品在121 ℃下高壓滅菌20 min，并放置在24 孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞接種。

1.2.4 細(xì)胞黏附

每個(gè)樣品上接種1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，固定細(xì)胞，梯度脫水干燥，掃描電鏡成像。

1.2.5 細(xì)胞增殖

將MC3T3-E1 細(xì)胞以5×104細(xì)胞/樣品的密度接種在24 孔板中的樣品上，分別培養(yǎng)1、3 和7 d。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)說明書加入CCK-8 工作液，并在37 ℃下培養(yǎng)2 h，在450 nm 處讀取光密度值。

1.2.6 抗菌效果

1.2.6.1 光熱抗菌效果

為了進(jìn)行光熱殺菌，將金黃色葡萄球菌ATCC12600 菌液稀釋至5×104個(gè)細(xì)菌/mL 的濃度。向含有PDA-NP 涂層鈦樣品（Ti-PDA）的24 孔板中添加1 mL 細(xì)菌懸浮液，葡萄球菌黏附于PDA-NP涂層鈦表面。1 h 后，PBS 洗滌樣品并轉(zhuǎn)移到新的孔中，進(jìn)行3 min 的NIR 輻照。輻照后，將樣品進(jìn)行超聲后，取表面黏附細(xì)菌，置于血液瓊脂平板，37 ℃下培養(yǎng)48 h，然后計(jì)數(shù)所形成的菌落單位（CFU）。

1.2.6.2 光熱抗菌對(duì)細(xì)胞黏附的影響

為了模擬手術(shù)植入過程中的污染，取1 mL 葡萄球菌懸液（5×104個(gè)細(xì)菌），接種在24 孔板中的樣本表面。1 h 后，將樣品轉(zhuǎn)移到新孔中，PBS 洗滌3次。隨后，將500 μL MC3T3-E1 懸浮液（1×105個(gè)細(xì)胞）接種在樣本表面，37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)2 h后，以1 W/cm2的功率進(jìn)行3 min 的近紅外輻照（808 nm）。培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行FITC-phalloidin 和DAPI 染色，并使用熒光顯微鏡拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鈦表面涂層的制備

SEM 觀察顯示，經(jīng)過堿熱處理的Ti 表面形成了均勻一致的多孔結(jié)構(gòu)，而Ti-PDA 表面明顯展示出與Ti 不同的表面結(jié)構(gòu)（圖1），可見PDA 粒子在涂層中的聚集。

圖1 SEM 圖像：Ti 和Ti-PDA 的表面形貌Fig.1 SEM images: Surface morphology of Ti and Ti-PDA

2.2 鈦表面涂層的光熱效果

Ti 表面經(jīng)NIR 輻照3 min 后，發(fā)生了接近4 ℃的輕微的光-熱轉(zhuǎn)換（圖2）。相同條件下，Ti-PDA 的溫度升高了約30 ℃。

圖2 Ti 和Ti-PDA 上808 nm（1 W/cm2）下NIR輻照3 min 后成像Fig.2 Irradiation imaging at 808 nm (1 W/cm2)for 3 min of NIR on Ti and Ti-PDA

2.3 鈦表面涂層對(duì)細(xì)胞黏附的影響

接種早期的細(xì)胞的黏附和遷移對(duì)于之后的生長(zhǎng)、增殖和分化至關(guān)重要。本研究中，MC3T3-E1 在Ti 和Ti-PDA 上培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行掃描電鏡，結(jié)果顯示MC3T3-E1 與兩組鈦基質(zhì)結(jié)合均良好，細(xì)胞呈多邊形，而Ti-PDA 組的鈦表面細(xì)胞鋪展更好，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)（圖3）。

圖3 細(xì)胞黏附：在Ti 和Ti-PDA 上培養(yǎng)12 h 的MC3T3-E1 細(xì)胞的SEM 照片F(xiàn)ig.3 Cell adhesion: SEM images of MC3T3-E1 cells cultured on Ti and Ti-PDA for 12 h

2.4 鈦表面涂層對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 結(jié)果（圖4）表明，在生長(zhǎng)1、3 d 后，與對(duì)照組（CON）相比，Ti 和Ti-PDA 組均無顯著差異。但在第7 天，Ti-PDA 樣品的細(xì)胞增殖明顯高于Ti 組和對(duì)照組（P＜0.001）。

圖4 不同樣本表面分別培養(yǎng)1、3、7 天的MC3T3-E1 細(xì)胞增殖情況（***：P＜0.001）Fig.4 The proliferation of MC3T3-E1 cells on the surface of different samples cultured for 1,3,7 days respectively(***: P＜0.001)

2.5 鈦表面涂層的抗菌效果

Ti 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的能力有限，而在Ti-PDA 中可以清楚地觀察到有效的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象（圖5A），Ti-PDA 中S.aureus 的菌落數(shù)明顯小于Ti 組（圖5B）。

圖5 抗菌活性檢測(cè)（***：P＜0.001）Fig.5 Antibacterial activity examination (***: P＜0.001)

在模擬手術(shù)植入過程的污染模型中（圖6A），當(dāng)用NIR 照射至少3 min 后，Ti-PDA 組可見明顯的細(xì)胞黏附，說明涂層可以在植入之前對(duì)黏附的葡萄球菌進(jìn)行光熱殺滅，從而顯著改善細(xì)胞黏附（圖6B）。

圖6 MC3T3-E1 細(xì)胞與光熱抗菌涂層的相互作用Fig.6 The interaction between MC3T3-E1 cells and the photothermal antibacterial coating

3 討論

為了提高細(xì)胞在材料表面的黏附和生長(zhǎng)，眾多研究在植入材料表面制備納米圖形特征[14-15]。然而，部分研究結(jié)果適用性低、過于復(fù)雜和不實(shí)用的生產(chǎn)過程以及高制造成本，無法真正應(yīng)用于臨床。因此，在臨床植入物表面產(chǎn)生納米形貌的新技術(shù)開發(fā)應(yīng)側(cè)重于將功能性與適用性相結(jié)合。PDA 納米涂層因其易操作性和良好的生物相容性、可降解性，近年來受到越來越多的關(guān)注。

光熱治療不僅可以作為每次手術(shù)階段的感染預(yù)防措施，也可以作為術(shù)后階段的感染治療措施。在每次手術(shù)的早期，光熱治療可以殺死手術(shù)早期可能污染植入物表面的細(xì)菌，而散熱引起的組織損傷并不重要[16-17]。而在術(shù)后階段，使用光熱治療必須考慮散熱引起的組織損傷。因此本研究從預(yù)防散熱導(dǎo)致的損傷出發(fā)，在植入物表面增加具有良好細(xì)胞黏附性能的光熱抗菌涂層，成功制備出Ti-PDA 樣品。

雖然鈦基合金是最常用的生物醫(yī)學(xué)植入材料，但其固有的惰性并不能促進(jìn)植入物表面與周圍骨的牢固結(jié)合。鈦合金不能增強(qiáng)宿主組織中成骨細(xì)胞的成骨活性是導(dǎo)致種植體松動(dòng)的主要原因[18-19]。本研究中，Ti-PDA 顯示出優(yōu)異的促成骨細(xì)胞黏附和增殖的能力，有望顯著促進(jìn)植體的骨整合效果。

4 結(jié)論

研究證實(shí)，具有聚多巴胺納米粒子光熱涂層的生物植入物Ti-PDA 具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖；同時(shí)，該涂層在光熱效果下具有良好的抗菌性能，殺死污染表面的細(xì)菌并同時(shí)有效維持細(xì)胞黏附，促進(jìn)組織整合。