膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清細(xì)胞因子樣蛋白1水平變化及臨床意義

王 漢，符林雄 ，李儒琳

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院骨科，?？?570208;2.瓊海市人民醫(yī)院骨科，海南 瓊海 571400)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是人類最常見的退化性骨關(guān)節(jié)疾病之一，其特征是關(guān)節(jié)軟骨逐漸退化和喪失，可累及全身各關(guān)節(jié)，尤其以膝關(guān)節(jié)OA(KOA)發(fā)病率最高[1-2]。KOA臨床癥狀通常只有在軟骨已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)地被破壞時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，因此若不能得到有效控制，患者常會(huì)面臨關(guān)節(jié)疼痛、功能喪失等風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。目前臨床上對(duì)于KOA的預(yù)防治療仍缺乏行之有效的手段，部分原因與其發(fā)病機(jī)制不明確有關(guān)。細(xì)胞因子樣蛋白1(CYTL-1)是一種新型的自分泌型調(diào)節(jié)因子，在軟骨細(xì)胞中高度表達(dá)，參與軟骨的形成和發(fā)育以及關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[5]。CYTL-1最初被確定為調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞成熟的重要分子[6]，有研究[7]發(fā)現(xiàn)CYTL-1亦具有細(xì)胞因子樣特性和趨化因子活性，在組織再生方面發(fā)揮新的作用，并有可能成為疾病控制治療藥物輸送的靶標(biāo)。因此本研究旨在分析原發(fā)性KOA患者血清和滑液CYTL-1水平變化，以及與疼痛程度和身體殘疾程度的相關(guān)性，從而為利用血清CYTL-1早期識(shí)別關(guān)節(jié)軟骨破壞的高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體以及作為OA治療的新靶點(diǎn)提供證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2016年2月至2021年10月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院收治的122例KOA患者(KOA組)作為研究對(duì)象，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科分會(huì)《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》[8]制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1)近1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)反復(fù)膝關(guān)節(jié)疼痛；2)X線片(站立或負(fù)重位)顯示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和(或)囊性變、關(guān)節(jié)緣骨贅形成；3)年齡>40歲；4)晨僵時(shí)間<30 min；5)活動(dòng)時(shí)有骨摩擦音。滿足上述1)和2)—5)中任意2條即可診斷為KOA。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合上述KOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且至少有一個(gè)膝關(guān)節(jié)Kellgren-Lawrence分級(jí)≥Ⅱ級(jí)，VAS評(píng)分≥4分；2)患者知情同意本研究?jī)?nèi)容，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有膝關(guān)節(jié)手術(shù)史、外傷史或患肢有血管神經(jīng)損傷史者；2)合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、膝關(guān)節(jié)腫瘤或結(jié)核、嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥或合并其他部位OA者；3)合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病，嚴(yán)重精神疾病，嚴(yán)重心、肝、腎、凝血功能障礙，或服用抗凝劑，妊娠者。

所有患者均持續(xù)服用塞來昔布。另選取同期年齡、性別組成、體重指數(shù)(BMI)相匹配、于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院體檢的健康受試者165例作為對(duì)照組。對(duì)照組受試者均沒有炎癥性疾病或其他部位骨關(guān)節(jié)炎。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 血清和滑液CYTL-1的檢測(cè)

空腹、靜脈穿刺獲取血樣5 mL，并靜置1 h后分離血清。5 d內(nèi)測(cè)量的樣品保存在4 ℃冰箱中，1周以后測(cè)量的樣品保存在-20 ℃冰箱中。

外側(cè)入路采集膝關(guān)節(jié)滑液，對(duì)于雙側(cè)KOA患者，選擇Kellgren-Lawrence分級(jí)更高的關(guān)節(jié)采集滑液。將支架放置在膝蓋下方，膝蓋彎曲30°，然后用5 mL無菌注射器插入髕骨側(cè)部，將針頭向下和向內(nèi)側(cè)推進(jìn)至髕骨后外側(cè)方向，到達(dá)滑膜間隙。從滑膜腔抽出約2 mL滑液，在-80 ℃儲(chǔ)存。

采用美國(guó)BioTek Instruments公司生產(chǎn)的ELX800酶標(biāo)記物，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清和滑液CYTL-1水平。試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，所有步驟均按照制造商說明書嚴(yán)格操作。

1.3 身體殘疾程度評(píng)估

KOA患者均采用西大略湖麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)(WOMAC)[9]作為身體殘疾程度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，雙膝發(fā)病者以較重一側(cè)的分?jǐn)?shù)為依據(jù)。該量表包括疼痛、關(guān)節(jié)僵硬及日常活動(dòng)3個(gè)部分，共24個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目均采用5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分?？偡衷礁?，提示殘疾程度越嚴(yán)重，95%置信區(qū)間(CI)最小可檢測(cè)到的變化為16.1。根據(jù)總積分評(píng)估骨關(guān)節(jié)炎的輕重程度：輕度<80分，中度80～120分，重度>120分。

1.4 疼痛程度評(píng)估

根據(jù)視覺模擬數(shù)字評(píng)價(jià)量表(VAS)進(jìn)行評(píng)分，用以評(píng)估KOA患者疼痛程度。詢問患者下蹲、起立動(dòng)作時(shí)的主觀疼痛感受，分?jǐn)?shù)0～10分，0分為無痛，10分為劇痛，VAS評(píng)分越高，表示患者疼痛程度越大。95%CI最小可檢測(cè)到的變化為0.08。4～6分為中度疼痛，7～10分為重度疼痛。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2組一般資料比較、KOA患者血清CYTL-1水平與臨床病理特征的關(guān)系采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。通過Spearman等級(jí)相關(guān)分析和多元線性回歸模型分析血清CYTL-1與WOMAC評(píng)分、VAS評(píng)分的關(guān)系。繪制受試者工作特性(ROC)曲線分析血清CYTL-1水平對(duì)KOA患者重度疼痛及殘疾的診斷價(jià)值的曲線下面積(AUC)和最佳cut-off值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者一般資料

2組年齡、性別、職業(yè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但KOA組BMI高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組受試者一般資料比較

2.2 2組受試者血清CYTL-1水平比較及其對(duì)KOA的診斷價(jià)值

KOA組血清CYTL-1水平低于對(duì)照組[169.10(114.24，233.28)ng·mL-1比316.11(240.17，379.12)ng·mL-1，P<0.001]。為了排除年齡、性別、BMI、職業(yè)等客觀因素的干擾，經(jīng)Logistic回歸分析后，血清CYTL-1水平降低仍然是KOA發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(β=-0.013，Walds=45.874，Exp(β)=0.987，95%CI:0.983～0.991，P<0.001)。經(jīng)ROC曲線分析，血清CYTL-1用于KOA診斷的AUC為0.834(95%CI：0.787～0.881)，見圖1—2。

圖1 2組受試者血清CYTL-1水平 圖2 血清CYTL-1對(duì)KOA的診斷效能

2.3 KOA患者滑液和血清CYTL-1水平的關(guān)系

KOA患者滑液CYTL-1水平為328.92(206.80，495.54)ng·mL-1。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，與血清CYTL-1水平呈正相關(guān)(rS=0.521，P<0.001)。校正單膝和雙膝發(fā)病因素后，多元線性回歸分析顯示，KOA患者血清和滑液CYTL-1水平仍保持正相關(guān)(β=0.243，95%CI=0.178～0.308，P<0.001)。

2.4 KOA患者血清CYTL-1水平與WOMAC及VAS評(píng)分相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析顯示，KOA患者的血清CYTL-1水平與WOMAC、VAS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(rS=-0.455、-0.421，P<0.001)，見圖3。經(jīng)多元線性回歸分析，在校正年齡、性別、BMI、職業(yè)等混雜因素后，回歸模型檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.314，P<0.001)，血清CYTL-1水平與WOMAC總評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(β=-0.373，95%CI=-0.004～-0.002，P=0.002)，其中疼痛評(píng)分(β=-0.281，95%CI=-0.009～-0.002，P=0.041)、僵硬評(píng)分(β=-0.345，95%CI=-0.017～-0.001，P=0.011)、關(guān)節(jié)功能評(píng)分(β=-0.499，95%CI=-0.008～-0.001，P<0.001)。血清CYTL-1水平與VAS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(β=-0.218，95%CI=-0.003～-0.001，P<0.001)。

圖3 KOA患者血清CYTL-1水平與WOMAC及VAS評(píng)分的Spearman相關(guān)性

2.5 KOA患者血清CYTL-1水平與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)KOA患者血清CYTL-1水平中位值(169.10 ng·mL-1)，將KOA患者分為低水平組(<169.10 ng·mL-1)、高水平組(≥169.10 ng·mL-1)。結(jié)果顯示低水平組較高水平組Kellgren-Lawrence分級(jí)、軟骨缺損評(píng)分以及站起-走計(jì)時(shí)(TUG)測(cè)試秒數(shù)均更高(P<0.05)，見表2。

2.6 血清CYTL-1水平對(duì)KOA患者重度疼痛及殘疾的診斷價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，血清CYTL-1水平診斷KOA患者重度疼痛及殘疾的AUC分別為0.774(95%CI：0.685～0.863)、0.704(95%CI：0.602～0.791)。見表3和圖4—5。

表2 KOA患者血清CYTL-1水平與人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料及臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

表3 血清CYTL-1水平對(duì)KOA患者重度疼痛及殘疾的診斷價(jià)值

圖4 血清CYTL-1水平診斷KOA患者重度疼痛ROC曲線 圖5 血清CYTL-1水平診斷KOA患者重度殘疾ROC曲線

3 討論

KOA是一種進(jìn)行性慢性疾病，其特征是軟骨退行性變、軟骨下骨形成和滑膜改變，并引起疼痛、腫脹和運(yùn)動(dòng)受限等臨床癥狀[1]。臨床上認(rèn)為KOA發(fā)病隱匿，當(dāng)患者因不適就醫(yī)時(shí)往往膝關(guān)節(jié)已出現(xiàn)不可逆性損傷[11]，因此KOA患者疼痛及身體殘疾程度準(zhǔn)確診斷對(duì)后續(xù)治療是至關(guān)重要的。本研究根據(jù)既往研究結(jié)論，對(duì)CYTL-1與KOA的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KOA患者血清CYTL-1水平顯著低于對(duì)照組[169.10(114.24，233.28)ng·mL-1比316.11(240.17，379.12)ng·mL-1，P<0.001]，此外，血清CYTL-1水平<169.10 ng·mL-1的患者Kellgren-Lawrence分級(jí)為4級(jí)(78.79%比21.21%)、軟骨缺損評(píng)分≥22.67 分(70.18%比29.82%)以及TUG測(cè)試秒數(shù)≥5.95 s(60.66%比39.34%)的占比均更高，提示CYTL-1可能與KOA的疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

WOMAC評(píng)分量表是評(píng)估下肢(髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié))OA患者疼痛、關(guān)節(jié)僵硬及日常活動(dòng)的自我報(bào)告疾病特異性工具，WOMAC評(píng)分已經(jīng)被臨床應(yīng)用于手術(shù)、藥物、生物制劑、儀器及物理治療后的療效評(píng)估，且被證實(shí)可以提高患者的依從性[12-13]。但其評(píng)分的準(zhǔn)確度常受到患者身體其他區(qū)域疼痛串?dāng)_的影響，從而易產(chǎn)生評(píng)估誤差[4]。VAS評(píng)分使用范圍更加廣泛，如在腹股溝疝、腰間盤突出等疾病評(píng)估中使用[14-15]，且受到患者主觀感受差異影響，也易伴有誤差。而生物標(biāo)志物是指能客觀測(cè)量并且可以評(píng)估正常生理代謝過程、病理變化以及治療效果的生化指標(biāo)，客觀性、準(zhǔn)確性更佳。本研究血清CYTL-1與WOMAC總評(píng)分(β=-0.373，95%CI：-0.004～-0.002，P=0.002)、疼痛評(píng)分(β=-0.281，95%CI：-0.009～-0.002，P=0.041)、僵硬評(píng)分(β=-0.345，95%CI：-0.017～-0.001，P=0.011)、關(guān)節(jié)功能評(píng)分(β=-0.499，95%CI：-0.008～-0.001，P<0.001)均存在獨(dú)立負(fù)相關(guān)，提示血清CYTL-1在一定程度上能夠反映疾病進(jìn)展情況。

CYTL-1為具有136個(gè)氨基酸的分泌蛋白，是一種多功能新型細(xì)胞因子，它最初在來自人臍帶血、外周血和骨髓的CD34+造血干/祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在軟骨細(xì)胞中CYTL-1也呈高表達(dá)[16-17]。細(xì)胞因子在OA的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α、白介素-6等(IL-6)，在OA的炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。CYTL-1為新型細(xì)胞因子，其在軟骨細(xì)胞中特異性高表達(dá)[17]，既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]已發(fā)現(xiàn)敲除CYTL-1的小鼠表現(xiàn)出正常的軟骨內(nèi)骨化和長(zhǎng)骨發(fā)育，同時(shí)CYTL-1可負(fù)調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞的成骨，正向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的成骨，從而調(diào)節(jié)小鼠的骨量。軟骨發(fā)育始于間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，眾多研究認(rèn)為CYTL-1參與軟骨的形成、發(fā)育以及OA的發(fā)生、發(fā)展[18]。已知CYTL-1可增加軟骨形成過程中IL-1的表達(dá)。此外，CYTL-1具有很強(qiáng)的促血管生成作用，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A 作用相當(dāng)。CYTL-1還被發(fā)現(xiàn)參與巨噬細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)，CYTL-1的結(jié)構(gòu)-功能分析表明它可能采用IL-8樣趨化因子折疊，特別類似于CCL2，并且CYTL-1還表現(xiàn)出對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化作用[7,19-20]。本研究結(jié)果顯示KOA患者血清CYTL-1水平普遍降低，且與滑液CYTL-1表達(dá)呈獨(dú)立正相關(guān)(rS=0.521，P<0.001)。近年來，血清和滑液中的生物標(biāo)記物代表了一組潛在的新工具，可作為常規(guī)診斷成像檢查之外的輔助檢測(cè)手段。雖然與血清相比，滑液中細(xì)胞因子水平的變化可能更能夠直接反映關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展程度。但是滑液樣本的采集屬于侵犯性操作，而血清生物標(biāo)記物更容易檢測(cè)，本研究也證實(shí)血清CYTL-1與WOMAC及VAS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，而且ROC曲線分析顯示，血清CYTL-1水平對(duì)于KOA患者重度疼痛[0.774(95%CI：0.685～0.863)]及重度殘疾[0.704(95%CI：0.602～0.791)]都有診斷價(jià)值，說明檢測(cè)血清樣本CYTL-1可以客觀地評(píng)估疾病活動(dòng)，有助于預(yù)測(cè)疾病預(yù)后和評(píng)估治療反應(yīng)。

4 結(jié)論

KOA患者血清CYTL-1水平降低與疾病發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，因此有望成為KOA治療的新靶點(diǎn)以及檢測(cè)疾病進(jìn)展的新型生化指標(biāo)。然而本研究有一些不可避免的局限性需要考慮，首先，這項(xiàng)橫斷面研究納入樣本較少，有必要在更大的人群中進(jìn)行研究加以驗(yàn)證；其次，出于倫理原因，未測(cè)量健康人滑液樣本中CYTL-1水平；第三，沒有研究透明質(zhì)酸注射或手術(shù)是否會(huì)改變KOA患者滑液和血清CYTL-1水平；最后，只測(cè)量了CYTL-1水平，若增加其他潛在趨化因子可能會(huì)獲得對(duì)KOA病情進(jìn)展更有用的信息。