miR-185-5p靶向AKR1C1抑制肺癌細胞的遷移和侵襲

贠宇輝，楊三虎，楊 鋒

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸腔外科，西安 710000)

肺癌是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，包括非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)[1-2]。NSCLC占所有肺癌的80%～85%，其中以腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌最常見[3]。轉(zhuǎn)移、復發(fā)是NSCLC患者死亡的主要原因[4]。因此，闡明NSCLC轉(zhuǎn)移機制，尋找新的轉(zhuǎn)移相關因子，開發(fā)轉(zhuǎn)移相關靶向藥物在改善其預后方面具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是一種短片段的單鏈內(nèi)源性保守的RNA分子，通過調(diào)控靶基因在疾病中發(fā)揮作用[5]。miR-185-5p是新近發(fā)現(xiàn)的在肺癌中失調(diào)的miRNA之一，其參與乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等多種實體瘤的發(fā)展[6-8]。醛酮還原酶1家族成員C1(aldehyde ketone reductase 1 family member C1，AKR1C1)是人類醛酮還原酶家族成員，該家族由AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4 4種酶組成，均具有催化還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的作用[9]。有研究[10]證實，AKR1C1參與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥惡變過程，但是其與miR-185-5p在肺癌中的關系尚不清楚。本研究擬以肺癌為研究對象，觀察miR-185-5p在肺癌組織和細胞中的表達及其對肺癌細胞遷移侵襲的影響，并探討miR-185-5p與AKR1C1之間的靶向關系，為晚期肺癌治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

收集空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院2018年4月至2021年1月期間行肺癌切除術患者的癌及對應癌旁組織標本各31例。所有患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。入選標準：1)自愿參與并簽署知情同意書；2)符合中華醫(yī)學會肺癌臨床診療指南(2019版)[10]診斷肺癌的標準。排除標準：1)合并其他惡性腫瘤；2)不符合醫(yī)學倫理，如孕婦、晚期且生存期不足3個月者。

1.2 細胞系和主要試劑

人正常肺上皮細胞BEAS-2B、肺癌細胞A549、H460均購自美國菌種保藏中心；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；LipofectamineTM3500轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol液均購自美國Invitrogen公司；RT-qPCR試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；Transwell小室(8.0 μm)購自美國Corning公司；兔抗人AKR1C1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自上海Abcam公司；ECL發(fā)光液購自上海伯樂生命醫(yī)學科技公司；雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒購自美國Promega公司；miR-185-5p、anti-miR-185-5p、AKR1C1-WT、AKR1C1-MUT及所有引物的設計合成均由上海吉瑪科技有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組

將組織樣本分為癌旁組和肺癌組；常規(guī)培養(yǎng)的BEAS-2B、A549、H460細胞分別標記為BEAS-2B組、A549組、H460組；A549細胞轉(zhuǎn)染實驗分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-185-5p組(轉(zhuǎn)染miR-185-5p)、miR-185-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-185-5p和pcDNA)、miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組(共轉(zhuǎn)染miR-185-5p和pcDNA-AKR1C1)。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與A549細胞轉(zhuǎn)染

于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BEAS-2B、A549、H460細胞。每隔2～3 d更換1次細胞培養(yǎng)基。按照脂質(zhì)體：質(zhì)粒或核酸序列為3:1的比例混勻后與A549細胞共培養(yǎng)12 h，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，RT-qPCR或蛋白免疫印跡實驗驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 RT-qPCR實驗檢測miR-185-5p、AKR1C1的表達

將需要檢測的組織充分研磨，細胞收集待用。用TRIzol液提取總RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。使用RT-qPCR試劑盒檢測模板中miR-185-5p、AKR1C1的表達情況。以U6或GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct計算miR-185-5p、AKR1C1的相對表達量。引物信息見表1。

表1 靶基因的引物序列

1.3.4 Transwell 實驗檢測細胞的遷移和侵襲

將需要檢測的細胞用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，再用無血清培養(yǎng)基調(diào)整至5×104個·mL-1，待用。取200 μL置于Transwell小室的上層，均勻涂抹，下室置于600 μL的含血清培養(yǎng)基，37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出小室，拭去未發(fā)生穿膜的細胞，用甲醇固定20 min，甲基藍結(jié)晶紫染液染色15 min，顯微鏡下觀察計數(shù)細胞的數(shù)目。計數(shù)3次，取平均值。細胞侵襲實驗的操作步驟同上，Transwell小室更換為含有基質(zhì)膠的上層膜。

1.3.5 劃痕實驗檢測細胞傷口愈合

將待檢測的細胞接種到6孔板，每孔5×105個。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合度達90%，用無菌10 μL槍頭，垂直細胞板劃出“一”字傷口，再用無血清培養(yǎng)基漂洗。倒置顯微鏡下拍照記錄原始的劃痕寬度。再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后記錄愈合后傷口寬度。使用Image J軟件分析傷口的愈合率(%)=(初始傷口寬度-愈合后傷口寬度)/初始傷口寬度×100%。

1.3.6 蛋白免疫印跡實驗檢測AKR1C1、MMP-2、MMP-9的蛋白表達

充分無菌研磨組織，用4倍體積的裂解液充分裂解，提取總蛋白。待檢測的細胞使用裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，沸水浴法變性蛋白，取10 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE蛋白電泳，并將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃孵育處理2 h。充分洗膜，浸入稀釋好的一抗(AKR1C1、MMP-2、MMP-9)中4 ℃孵育過夜。充分洗膜，浸入稀釋過的二抗溶液(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔)中，37 ℃孵育2 h。洗膜，滴加ECL電化學發(fā)光試劑顯影、曝光。Image J軟件分析蛋白的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示目的蛋白的相對表達。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測細胞熒光素酶活性

使用靶基因在線預測網(wǎng)站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預測miR-185-5p的下游靶基因?；瘜W合成含有AKR1C1 3′UTR結(jié)合位點的片段(AKR1C1-WT)、不含AKR1C1 3′UTR結(jié)合位點的突變片段(AKR1C1-MUT)，并插入熒光載體，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體。將載體分別與miR-NC、miR-185-5p、anti-miR-NC、anti-miR-185-5p共轉(zhuǎn)染A549細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測分析細胞的熒光素酶活性。

1.3.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miR-185-5p在肺癌組織和細胞系中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示：肺癌組miR-185-5p的表達水平較癌旁組顯著降低[(0.46±0.06)比(1.00±0.09)，t=14.977，P<0.001]；與BEAS-2B組(1.01±0.07)比較，A549組(0.25±0.07)和H460組(0.57±0.06)miR-185-5p的表達水平均顯著降低(F=293.373，P<0.001)。

2.2 過表達miR-185-5p對A549細胞遷移、侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-185-5p組A549細胞的miR-185-5p表達[(3.79±0.46)比(0.99±0.07)，t=18.053，P<0.001]顯著升高，遷移細胞數(shù)[(77±8)比(100±8)，t=6.099，P<0.001]和侵襲細胞數(shù)[(48±6)比(74±8)，t=7.800，P<0.001]及劃痕愈合率[(47.83±4.42)%比(81.79±8.85)%，t=10.294，P<0.001]均顯著降低，MMP-2 [(0.59±0.07)比(0.98±0.08)，t=11.006，P<0.001]、MMP-9 [(0.42±0.08)比(0.99±0.07)，t=16.086，P<0.001]的蛋白表達均顯著降低。見圖1。

A：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；B：劃痕實驗檢測細胞傷口愈合；C：蛋白免疫印跡檢測蛋白表達。

2.3 miR-185-5p靶向AKR1C1

Starbase預測結(jié)果顯示：miR-185-5p與AKR1C1之間存在連續(xù)的互補結(jié)合序列。見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-185-5p組AKR1C1-WT細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見圖2B。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-185-5p組細胞中AKR1C1蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-185-5p組細胞中AKR1C1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖2C。

A：Starbase預測結(jié)果；B：雙熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性；C：蛋白免疫印跡實驗檢測AKR1C1蛋白表達；1為miR-NC組；2為miR-185-5p組；3為anti-miR-NC組；4為anti-miR-185-5p組；*P<0.05與miR-NC組比較；#P<0.05與anti-miR-NC組比較。

2.4 AKR1C1在肺癌組織和細胞系中的表達

與癌旁組比較，肺癌組中AKR1C1 mRNA [(6.21±0.86)比(1.01±0.09)，t=18.041，P<0.001]和蛋白表達[(1.87±0.19)比(0.99±0.10)，t=12.296，P<0.001]均顯著升高；與BEAS-2B組比較，A549組細胞中AKR1C1 mRNA [(3.78±0.52)比(1.00±0.09)，t=15.804，P<0.001]和蛋白表達[(1.55±0.17)比(1.01±0.09)，t=8.422，P<0.001]均顯著升高。見圖3。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測AKR1C1蛋白在肺癌組織和細胞系中的表達

2.5 過表達AKR1C1部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-185-5p對A549細胞遷移、侵襲的抑制

與miR-185-5p+pcDNA組比較，miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組A549細胞中miR-185-5p表達[(0.47±0.06)比(1.01±0.08)，t=186.088，P<0.001]顯著降低，遷移細胞數(shù)[(95±8)比(80±8)，t=11.297，P<0.001]、侵襲細胞數(shù)[(71±8)比(50±6)，t=30.640，P<0.001]及劃痕愈合率[(83.15±8.86)%比(50.99±8.81)%，t=54.341，P<0.001]均顯著升高；，MMP-2 [(1.38±0.17)比(0.99±0.10)，t=26.171，P<0.001、MMP-9的蛋白表達[(1.66±0.09)比(0.98±0.04)，t=84.991，P<0.001]均顯著升高。見圖4。

A：Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲；B：劃痕實驗檢測細胞傷口愈合；C：蛋白免疫印跡檢測蛋白表達；1為miR-185-5p組；2為miR-185-5p+pcDNA組；3為miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組。

3 討論

miR-185-5p在多種人類癌癥中發(fā)揮抗癌作用，但是其作用機制仍不明確。近期有研究[11]顯示，miR-185-5p在NSCLC組織和細胞中表達失調(diào)，其通過靶向Rab鳥嘌呤三核苷酸磷酸酶家族成員(RAB35)參與癌細胞的增殖、遷移侵襲過程。CAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肺鱗癌中miR-185-5p不僅作為前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物1(lncRNA PART1)的下游靶點，還直接靶向下游的sineoculis同源框同源物1(Six1)，調(diào)控肺鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡，參與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展。LI等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p作為長非編碼RNA(LncRNAs)LINC00205的下游靶點，減弱LINC00205對肺腺癌增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)腫瘤生長的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p在肺癌組織和肺癌細胞系中的表達降低；過表達miR-185-5p可明顯抑制肺癌細胞的遷移、侵襲及其相關基因MMP-2、MMP-9的蛋白表達。故本研究證實miR-185-5p作為抑癌因子在肺癌中發(fā)揮抗癌作用，這與前述研究報道相一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p直接靶向AKR1C1，且負向調(diào)控肺癌細胞中AKR1C1蛋白的表達，這提示miR-185-5p抑制肺癌的作用可能與AKR1C1的表達有關。

AKR1C1及其家族成員參與肺癌的致癌物多環(huán)芳烴的代謝，因此長期煙草侵蝕會誘導肺組織中AKR1C1的表達，參與吸煙相關肺癌的發(fā)病，還在雄激素、孕酮等固醇類激素的代謝中發(fā)揮重要作用[14-15]。除與激素相關的卵巢癌、膀胱癌有關外，AKR1C1與肺癌的發(fā)展亦緊密相關[15]。ZHU等[16-17]報道，AKR1C1伴轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中的表達異常上調(diào)，且與患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的風險和預后不良緊密相關；此外，AKR1C1的促腫瘤轉(zhuǎn)移作用與其激活STAT3與JAK2之間的相互作用進而促進STAT3的反式激活緊密相關，而脫乙?；窼irtuin 2(SIRT2)能夠使AKR1C1脫乙酰基，抑制STAT3靶基因的反式激活，從而抑制細胞的遷移。HUANG等[18]發(fā)現(xiàn)AKR1C1是肺癌生存相關基因，在肺癌中高表達，沉默AKR1C1可明顯抑制肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進鐵死亡。本研究也發(fā)現(xiàn)肺癌組織和細胞系中AKR1C1的表達顯著升高。而且，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達AKR1C1可部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-185-5p對肺癌細胞遷移、侵襲的抑制作用，這證實miR-185-5p抑制肺癌的作用是通過負性調(diào)控AKR1C1的表達來實現(xiàn)的。

綜上，miR-185-5p可抑制肺癌細胞的遷移、侵襲，該作用可能與靶向調(diào)控AKR1C1有關。但是，本研究僅是基于細胞水平的研究，后續(xù)應從動物水平驗證在肺癌中miR-185-5p與AKR1C1的關系及其作用。